RESUMO
Um protocolo de PCR multiplex foi estabelecido para a detecção do Banana streak virus (BSV) e do Cucumber mosaic virus
(CMV) em bananeiras micropropagadas. Estes vírus são responsáveis
por perdas na produção de bananas em todo o mundo. Alguns trabalhos
descrevem a integração do BSV no genoma B da bananeira. Contudo, a
existência de bananeiras híbridas livres do BSV tem sido demonstrada.
Ademais, determinadas estirpes do CMV não são transmitidas
mecanicamente sob condições de laboratório, nem tampouco detectadas
por testes sorológicos. Como conseqüência, a indexação de matrizes
para cultura de tecido algumas vezes se mostra ineficiente. A
metodologia apresentada neste trabalho sobrepõe esta dificuldade,
pois se baseia na detecção do ácido nucléico viral presente em
amostras foliares de bananeira. Na reação, foram usados os
oligonucleotídeos BADNA 1A e BADNA 4, para a detecção do BSV, e "CMV
senso" e "CMV antisenso" para a detecção do CMV. Após a eletroforese
foi verificada a presença de dois fragmentos de DNA amplificados
simultaneamente, um dos quais com 597 pb correspondente ao BSV e o
outro, com 488 pb, correspondente ao CMV. Este resultado indica que o
PCR multiplex pode ser utilizado como uma ferramenta
adicional na indexação do BSV e do CMV em bananeiras propagadas por
cultura de tecido.
Palavras-chave adicionais: Musa spp., PCR multiplex, BSV e CMV.
A bananeira (Musa
spp.) é uma das fruteiras mais cultivada nos países de clima
tropical e subtropical (18). Seus frutos representam a quarta
mercadoria mais importante comercializada no mundo e em muitas áreas
são considerados o principal produto alimentício (2). Em 2004, a
produção brasileira atingiu 6,6 milhões de toneladas, enquadrando
nosso país como um dos maiores produtores mundiais (www.faostat.fao.org).
Na evolução das bananeiras comestíveis participaram, principalmente, as espécies diplóides selvagens M. acuminata Colla e M. balbisiana
Colla, de modo que cada cultivar pode conter combinações variadas de
genoma completo dessas espécies (1). Esses genomas são denominados pelas
letras A (M. acuminata) e B (M. balbisiana), cujas
combinações resultam grupos diplóides (AA, BB e AB), triplóides (AAA,
AAB e ABB) e tetraplóides (AAAA, AAAB, AABB, ABBB) (1).
As
bananeiras comerciais são estéreis e, portanto, propagadas
vegetativamente. Tradicionalmente, isto é feito por meio de mudas, mas a
partir da última década, a cultura de tecidos tem sido adotada e assim,
germoplasma de bananeira é distribuído internacionalmente (20).
Entretanto,
como em outras culturas, problemas fitossanitários acompanham a
bananicultura. As doenças ocasionadas por vírus merecem atenção
especial. Os vírus podem ser transmitidos por insetos vetores e através
da propagação vegetativa, o que pode ocasionar uma ameaça à produção,
tanto nas áreas onde os vírus são endêmicos, quanto naquelas livres de
vírus, mas que recebem novas mudas (20). Até o momento, somente o Banana streak virus (BSV) e o Cucumber mosaic virus (CMV) foram registrados em bananeiras cultivadas no Brasil (8, 17).
As
bananeiras podem ser infectadas por mais de um vírus ao mesmo tempo
(6). Estudos demonstraram que bananeiras infectadas com o BSV apresentam
sintomas que podem ser muitas vezes confundidos com aqueles causados
pelo CMV, sendo deste modo indistinguíveis os sintomas causados pela
dupla infecção destes vírus (22).
O BSV pertence ao gênero Badnavirus,
as partículas virais são baciliformes, sem envelope, medindo de 120 a
150 nm de comprimento por 23 a 30 nm de diâmetro, contendo um dsDNA
circular de aproximadamente 7,4 kpb (23). Possui uma faixa restrita de
hospedeiras distribuídas entre diferentes cultivares de bananeira, de
plátano e, experimentalmente, de cana-de-açúcar (Saccharum ssp.)
(6, 16). Apresenta várias estirpes que podem ser identificadas através
de diferenças na patogenicidade e na sintomatologia em cultivares de
bananeira e cana-de-açúcar e, através de testes sorológicos e
moleculares (16). O vírus pode ser disseminado na natureza pelas
cochonilhas Planococcus citri Russo e Saccharicoccus sacchari
Ckll (Homoptera: Pseudococcidae) ou transmitido pelo rizoma da planta
(6). Os vegetais infectados podem apresentar sintomas de estrias
foliares, lesões foliares cloróticas, mosaico, má formação dos frutos e
diminuição do cacho. Os sintomas de estria e de mosaico ocorrem
esporadicamente durante o ano, dificultando sua identificação visual
(16). Ademais, o BSV apresenta um alto grau de heterogeneidade genômica e
sorológica, entre seus isolados (9, 16). Tal heterogeneidade impõe uma
séria restrição quanto à utilização de técnicas sorológicas e
moleculares para a sua detecção em germoplasma de Musa.
Já o CMV pertence ao gênero Cucumovirus,
apresenta distribuição cosmopolita e diferentes graus de virulência. As
partículas virais são isométricas, com 28 a 30 nm de diâmetro, contendo
ssRNA tripartido (23). Pode ser transmitido na natureza por várias
espécies de afídios, apresentando com estes uma relação do tipo não
persistente (4). As plantas de bananeiras enfermas podem apresentar
sintomas de necrose vascular, espessamento intermitente da nervura,
separação da bainha foliar externa do pseudocaule, clorose, mosaico,
nanismo, má formação dos frutos e, às vezes, morte do vegetal. O sintoma
de mosaico é melhor visualizado na estação fria (4).
Em
vista dos problemas fitossanitários causados por estes vírus, um
crescente comércio de plântulas de bananeira micropropagadas tem se
estabelecido visando a limpeza clonal das cultivares de maior interesse
econômico (21). Entretanto, relatos revelam a possibilidade de
seqüências do BSV integrarem-se no genoma de Musa sp., e que a
cultura de tecido possa ser um gatilho de infecção epissomal do vírus,
visto que altos títulos do BSV em progênies micropropagadas de matrizes
assintomáticas puderam ser obtidos (11, 12, 13, 19). Ademais, o teste
mais utilizado em escala comercial na diagnose viral em bananeira
(micropropagada ou não) é o ELISA, e o mesmo se restringe ao CMV (7).
Isso possibilita um escape na detecção de mudas infectadas com outros
vírus ou com estirpes virais do CMV que não são detectadas em testes
sorológicos (4, 24).
O objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento de um protocolo de PCR multiplex para a detecção simultânea do BSV e do CMV, em bananeiras micropropagadas e cultivadas no Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Material Vegetal
Amostras
foliares de plântulas de bananeiras provenientes de cultura de tecido
foram utilizadas neste trabalho. Dentre estas foram testadas seis
amostras da cultivar Pacovan (AAB) e uma da cultivar Prata Graúda
(AAAB). Para controle positivo do teste foi utilizada a cultivar Prata
Anã (AAB) apresentando infecção mista.
Extração dos ácidos nucléicos totais de bananeira
Na
purificação do DNA total das amostras foliares foi utilizado o produto
DNAzol (Invitrogen), e a metodologia do processo foi realizada conforme a
recomendação do fabricante. A extração do RNA total foi realizada
segundo a metodologia descrita por Hu et al. (15).
Reação de transcrição reversa
A
reação de transcrição reversa foi preparada segundo Brioso (5), no
qual em um volume final de 20 µl foram adicionados 12 ml de água
tratada com DEPC, 4 µl de 5 X tampão da enzima transcriptase reversa,
2 µl de mistura 2,5 mM de dNTPs, 50 pmoles do oligonucleotídeo "CMV
antisenso" (3), 1 µl de RNA total e 100 U da enzima transcriptase
reversa ("Superscript II" – Invitrogen). A mistura foi incubada a
37°C por uma hora, 94°C por cinco minutos e resfriada no gelo.
PCR multiplex
Foram adicionados em um tubo de polipropileno de 0,2 ml, 5µl de tampão 10X PCR da enzima Taq
DNA polimerase, 3 µl da mistura 2,5 mM de dNTP, 50 pmoles dos
oligonucleotídeos "BADNA 1A" e "BADNA 4" (14), e 12,5 pmoles dos
oligonucleotídeos "CMV senso" e "CMV antisenso" (3), 2 µl de MgCl2 50
mM, 1.25 U DNA polimerase (Taq DNA polimerase, Invitrogen), 2 µl
do produto de reação da transcrição reversa (cDNA), 2 µl de DNA
total de bananeira e água deionizada estéril para 50 µl de volume
final. O tubo foi submetido a PCR (reação em cadeia da polimerase) no
termociclador programável PTC-200 (MJ Research), nas seguintes
condições: um ciclo inicial de desnaturação de 94°C / 2 min., seguido
de 30 ciclos de 94°C / 15 seg., 52°C / 30 seg., 72°C / 1 min. e
extensão final de 72°C / 5 min.
Os
produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose a 1,0 % (p/v), contendo brometo de etídio (0,25 µg / ml) e
visualizados sob luz ultravioleta (UV). Como padrão de massa
molecular foi adotado o 1 kb DNA "Ladder" (Invitrogen).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com
a metodologia empregada foi possível diagnosticar a presença do BSV e
do CMV nas amostras analisadas. Após a eletroforese verificou-se a
presença de dois fragmentos de DNA amplificados simultaneamente: um
com 597 pb correspondente ao BSV e outro com 488 pb, correspondente
ao CMV .
Dentre as amostras de cultura de tecidos analisadas, as seis
amostras 'Pacovan' (AAB) e o controle positivo, Prata Anã (AAB),
apresentaram infecção mista do BSV com o CMV. Entretanto, a cultivar
Prata Graúda (AAAB) se mostrou livre do BSV. Este resultado reforça
os dados encontrados por Figueiredo et al. (10), que demonstram a
existência de bananeiras híbridas livres de BSV, e indica que o PCR multiplex pode ser utilizado na indexação do BSV e do CMV em bananeiras propagadas por cultura de tecido.
Atualmente,
a cultura de tecidos tem sido adotada em programas de melhoramento para
a propagação da bananeira em escala comercial. A erradicação de vírus
de bananeira por meio da cultura de meristema associada à termoterapia,
quimioterapia e crioterapia tem sido relatada (21). Entretanto, nas
amostras provenientes de cultura de tecidos analisadas, foram
constatados tanto o BSV quanto o CMV, o que revela que a cultura de
tecidos quando empregada visando a limpeza clonal de bananeira se mostra
em alguns casos ineficiente. Desta forma, a metodologia de diagnóstico
apresentada neste trabalho poderia ser aliada a limpeza viral, visando
não somente indexar matrizes, mas também verificar a presença dos vírus
nas plantas propagadas.
Recentes
relatos sugerem que todas as bananeiras híbridas estariam
potencialmente infectadas com o BSV, pois um complexo BSV integrante
denominado EPRV ("endogenous pararetrovirus sequence") presente no
genoma B da bananeira seria capaz de originar infecção epissomal, quando
a planta é submetida à cultura de tecidos (11, 12, 13, 19). Contudo,
recentes resultados obtidos pelo nosso grupo de pesquisa demostraram a
existência de bananeiras híbridas livres de BSV, sugerindo que há
possibilidade de que matrizes livres de BSV ainda sejam encontradas
(10).
O
CMV está amplamente distribuído no território nacional (17). No país, o
teste mais utilizado em escala comercial na diagnose deste vírus em
bananeira, micropropagada ou não, é o ELISA (7, 8). Porém, determinadas
estirpes do CMV não são transmitidas mecanicamente para plantas
indicadoras, nem tampouco detectadas por ELISA (4, 24). A metodologia
apresentada neste trabalho sobrepõe esta dificuldade, pois se baseia na
detecção do ácido nucléico viral presente em amostras foliares de
bananeira.
O
panorama atual da cultura da banana no Brasil e no mundo revela a
necessidade de medidas preventivas de controle. O desenvolvimento de uma
metodologia de indexação eficiente, sensível e rápida, permitiria a
pronta identificação de cultivares infectadas com estirpes virais já
existentes no território nacional, impedindo o escape e o trânsito de
mudas infectadas provenientes ou não de cultura de tecido.
Conseqüentemente, tal medida diminuiria a possibilidade de perdas na
produtividade da cultura da bananeira em função de infecção viral
simples ou mista.
quarta-feira, 28 de novembro de 2012
Comparação de dois métodos diagnósticos de escaldadura-das-folhas (Xanthomonas albilineans) da cana-de-açúcar
RESUMO
A escaldadura-das-folhas (Xanthomonas albilineans) é uma das principais doenças da cana-de-açúcar devido ao dano que causa e à dificuldade da sua correta identificação, especialmente quando a planta, embora infectada, não apresenta sintomas visíveis (fase latente da doença). Essa característica faz com que sua disseminação para novas áreas ocorra através do plantio de toletes aparentemente sadios. A redução na produtividade ocorre quando, em condições de stress hídrico, plantas passam a exibir sintomas crônicos e agudos da doença. Como a maioria das variedades comerciais atualmente cultivadas no Brasil são portadoras assintomáticas da doença, a correta diagnose da doença se constitui numa das principais medidas para o sucesso do controle. O presente trabalho objetivou examinar a eficiências de diferentes métodos diagnósticos de X. albilineans. Dados obtidos demonstraram que o método clássico de isolamento do patógeno em meio de cultura a partir da seiva dos internódios do colmo não foi confiável enquanto o método de amplificação por PCR detectou a bactéria em plantas com os três diferentes sintomas da doença.
Palavras-chave adicionais: Diagnose, sintoma latente, DNA, PCR, Saccharum.
A crescente conscientização dos graves problemas ambientais advindos da queima de energia fóssil faz com que todos os países do mundo procurem por fontes alternativas viáveis que possam substituir o petróleo. Nesse sentido, o Brasil se destaca por ter sucesso na substituição de uma fonte altamente poluente por uma renovável, que tem se mostrado economicamente viável graças à cana-de-açúcar. O etanol produzido da cana tem se mostrado uma alternativa confiável de substituição à gasolina nos motores automotivos, principalmente após o advento dos carros bicombustível. Some-se ainda a utilidade da cana-de-açúcar como fonte de energia, visto que após a retirada do suco (transformado posteriormente em açúcar ou etanol), o bagaço e a palha são usados na co-geração de energia fornecendo energia térmica, elétrica e mecânica, tanto para consumo da própria usina como para venda às companhias elétricas.
A demanda por etanol aumenta a cada ano devido à procura pelos carros flex, que cresce a uma proporção maior que a produção de cana-de-açúcar, fazendo com que a procura por esse tipo de carro seja maior que a produção de etanol hidratado. O açúcar também sofre uma forte valorização, pois tanto a safra brasileira, que responde por 44% do comércio mundial, como a indiana, outro grande fornecedor, sofreu redução da produção fazendo com que a perspectiva para a cana-de-açúcar do Brasil seja altamente favorável (1).
As estratégias que as usinas estão usando para atender à crescente demanda pelo produto se concentram na expansão da cultura para novas áreas e no aumento de produtividade em regiões tradicionais. A área com a cultura teve aumento significativo nos principais estados produtores na safra 2011/2012, onde S. Paulo se destacou com expansão de 203.834 ha da área existente, Minas Gerais com 152.427 ha, Goiás com 123.485 ha, Mato Grosso do Sul com 58.488 ha e Mato Grosso com 18.192 ha, totalizando 621.505 ha em todo o país (1). Esse constante incremento de novas áreas traz uma preocupação aos pesquisadores envolvidos com a cultura, pois muitas doenças importantes podem ser disseminadas através das mudas empregadas nessa expansão. Doenças como mosaico (Sugarcane mosaic virus), o raquitismo-da-soqueira (Leifsonia xyli subsp xyli), a escaldadura das folhas (Xanthomonas albilineans) e o carvão (Sporisorium scitamineum) tem nos toletes um eficiente meio de disseminação para novas áreas (8).
Dentre essas, a escaldadura das folhas é considerada uma das mais graves por afetar a qualidade do caldo da cana (9), causar morte de plantas em extensas áreas (4), estar disseminada em praticamente todas as regiões produtoras do Brasil e do mundo e ser de difícil identificação por apresentar sintoma latente (8).
A utilização de toletes provenientes de plantas doentes, porém assintomáticas faz com que a doença se dissemine facilmente para outras regiões. Uma vez plantada no campo, e sob condições de estresse climático, canas aparentemente sadias começam a apresentar sintoma agudo de escaldadura com queima das folhas, colapso súbito e morte de plantas (4). Relatos de ocorrência da doença e conseqüente dano à produtividade foram verificados nos Estados Unidos, México, Guatemala e Cuba (9).
Portanto, uma das principais medidas de controle da doença se concentra na sua correta diagnose, principalmente das canas assintomáticas, para que as mesmas possam ser descartadas antes dessas serem utilizadas como mudas. No Brasil, apesar da importância da cultura para a economia brasileira, pouca informação está disponível sobre os métodos que poderiam ser empregados para o exame diagnóstico da escaldadura-das-folhas.
Dentre os métodos de diagnose conhecidos estão o isolamento em meio de Wilbrink (8) ou meio semi-seletivo (3), sorológicos com antissoro mono ou policlonal (2) e os moleculares baseados na técnica de em PCR, com emprego de diversos conjuntos de "primers" (7,10).
Devido à falta de consenso sobre o método mais sensível de detecção da bactéria, já que para alguns pesquisadores o isolamento em meio semi seletivo se mostrou muito mais sensível que os métodos sorológicos e PCR (10), enquanto que para outros, a detecção da bactéria por isolamento em meio de cultura e sorologia a partir dos sintomas latentes não é confiável pela baixa concentração ou distribuição desigual do patógeno dentro dos tecidos da planta (2,3,6), o presente trabalho objetivou comparar o método de diagnose por isolamento do patógeno com o método baseado na amplificação de DNA total por PCR, utilizando-se de "primers" específicos.
Dez touceiras distintas do clone RB955434 com 12 meses de idade e que apresentavam perfilhos com os três tipos de sintomas de escaladadura-das-folhas foram empregadas nesse trabalho. De cada touceira foram separadas perfilhos com cada tipo de sintoma, extraindo-se, por centrifugação a 3000rpm por 15 min a seiva do internódio mais basal, mediano (quinto ou sexto entrenó) e apical (nono ou décimo entrenó).
A constatação da presença de X. albilineans foi feita por dois métodos. No método convencional, 100 µl da seiva obtida dos diferentes internódios foram espalhados na superfície da placa de Petri com Wilbrink (8) ou XAS sem inibidores (3) em três repetições para cada um dos internódios, totalizando 90 amostras para cada um dos meios de cultura. A incubação foi feita a 26º C, no escuro, por 6-7 dias, já que após esse período o crescimento das bactérias impossibilitava a individualização das mesmas. A confirmação da presença da bactéria em ambos os meios foi realizada pelo método molecular, após purificação das colônias suspeitas.
No método molecular, o DNA total foi extraído de 1,5 g de tecido dos diferentes internódios provenientes de perfilhos com os diferentes tipos de sintoma, de acordo com Murray & Thompson (5). As condições de amplificação por PCR foram realizadas segundo Pan et al. (7) utilizando-se os "primers" PGBL1 e PGBL2 propostos pelos autores. Os produtos da amplificação foram visualizados por meio de eletroforese em gel de agarose 2% e tampão 1 X de Tris-Borato-EDTA corados com brometo de etídio. Duas amostras foram empregadas como controle negativo: isolado de X. campestris pv. campestris, proveniente de couve e água milliQ autoclavada em substituição ao DNA molde. Como controles positivos também foram utilizados amostras de cultura pura de X. albilineans isolado ScXa01-01 e de seiva de uma planta com sintoma agudo de queima das folhas e brotação lateral causada pela doença.
A obtenção dos três tipos de sintomas distintos que caracterizam a escaldadura-das-folhas na cana-de-açúcar numa mesma touceira foi o diferencial que permitiu a condução deste trabalho. Esse tipo de amostragem não tinha sido empregada nos estudos realizados anteriormente (2,10) e permitiu comparar a eficiência dos diferentes métodos diagnósticos de escaldadura-das-folhas, em função dos sintomas apresentados pela planta doente.
Muitos fungos e colônias bacterianas de diferentes morfologias foram obtidos nos dois meios de cultura empregados. Das colônias bacterianas, todas aquelas semelhantes a X. albilineans, que se caracterizam por coloração amarela brilhante, convexas, bordos lisos, viscosas e não mucóides (8), foram posteriormente submetidas a diagnose molecular, o que permitiu avaliar com segurança a eficiência de cada meio de cultura em isolar a bactéria. O isolamento em meio de cultura XAS sem inibidores se mostrou mais eficiente que o de Wilbrink visto que crescimento do patógeno foi verificado em amostras de caldos advindos dos três tipos de sintomas, embora os valores da porcentagem de detacção do patógeno tenham sido distintos em função da posição do internódio no colmo e do tipo de sintoma. No entanto, nenhuma das dez amostras advindas dos colmos da região mediana da planta com sintoma latente apresentou crescimento positivo do patógeno. O meio de cultura Wilbrink teve desempenho inferior ao de XAS, não apresentando crescimento da bactéria nas amostras com sintoma latente e mesmo em plantas sintomáticas, o nível de detecção não ultrapassou 30%. Nos dois meios de cultura empregados, a recuperação da bactéria se deu de forma errática, não apresentando correlação ao tipo de sintoma e posição do internódio no colmo da planta. Em plantas com sintoma latente a porcentagem de crescimento da bactéria foi zero (meio Wilbrink) ou muito baixo (meio XAS sem inibidores) e mesmo nas sintomáticas a eficiência de detecção pode ser considerada baixa. Nenhuma tentativa de incorporação de inibidores para aumentar a eficiência desses meios foi realizada, embora o meio XAS tenha tido um desempenho superior ao de Wilbrink na detecção de X. albilineans.
Esses dados do presente trabalho estão de acordo com os observados por Comstock et al. (2). Os autores verificaram que quando o método de detecção de X. albilineans for feito através do isolamento da bactéria em meio de cultura, a posição do internódio no colmo da planta para a extração do caldo teve influência na recuperação da bactéria, apresentando portanto, baixa confiabilidade. Entretanto, segundo Davis et al. (3), em estudos realizados para avaliar métodos de isolamento e imunológicos na detecção de X. albilineans, o isolamento em meio semi-seletivo foi o método mais eficiente de detecção. Resultados semelhantes foram também descritos por Wang et al. (10).
De acordo com a literatura, os métodos imunológicos de detecção da bactéria, como ELISA ("Enzime-linked Immunosorbent Assay") e TBIA ("Tissue Blot Enzime Immunoassay") (2,3,10), também apresentam falhas, sendo que nenhum deles foi capaz de detectar a doença em 100% dos casos, mesmo em plantas sintomáticas. As razões para tal insucesso variaram desde alto nível de contaminação por outras bactérias habitantes dos vasos condutores da cana-de-açúcar (3), a distribuição desuniforme da bactéria nas diferentes partes da planta (9) e baixo título da bactéria na seiva extraída de colmos de cana com sintoma latente quando comparado com os caldos de plantas sintomáticas (3). No presente trabalho, a superioridade do método molecular ficou evidente pela detecção em 100% dos casos, independentemente do tipo de sintoma apresentado pela planta e o local de retirada da seiva no internódio da planta. Os produtos de PCR obtidos a partir de caldos advindos de colmos da parte basal, mediana e superior de plantas assintomáticas, resultaram em um fragmento específico esperado de 288 pares de bases (PB).
A crescente mecanização na cultura de cana-de-açúcar faz com que o método diagnóstico de doenças ganhe destaque e seja um dos principais requisitos para o sucesso das estratégias de controle de doenças. Isso porque o material propagativo empregado na implantação da cultura pode servir de fonte de inóculo primário de doenças que são transmitidas através de mudas contaminadas (8), especialmente a longas distâncias, em áreas novas de expansão da cultura de cana-de-açúcar, o que está ocorrendo em todas as regiões produtoras do Brasil (1). Uma vez a doença instalada na lavoura, a transmissão para outras plantas dentro do mesmo campo vai se dar especialmente através de facões e colheitadeiras (9). Nesse contexto, o presente trabalho mostrou que o método diagnóstico molecular foi eficiente em 100% das amostras de plantas doentes assintomáticas, se constituindo em ferramenta importante na detecção da escaldadura-das-folhas.
Embora a técnica BIO-PCR tenha apresentado melhores resultados que o PCR normal na detecção de escaldadura-das-folhas (10), resultados do presente estudo demonstraram que o PCR convencional pode ser o empregado pois conseguiu detectar a doença de todas as plantas assintomáticas. A técnica BIO-PCR necessita que o patógeno cresça em meio artificial por quatro dias enquanto no presente trabalho a extração do DNA do tecido foi feita em um dia, proporcionado uma rapidez na diagnose, sem gasto adicional de tempo, vidraria e reagentes.
URASHIMA, Alfredo Seiiti; ZAVAGLIA, Aline Cristine. Comparação de dois métodos diagnósticos de escaldadura-das-folhas (Xanthomonas albilineans) da cana-de-açúcar. Summa phytopathol., Botucatu, v. 38, n. 2, jun. 2012 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-54052012000200009&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-54052012000200009.
A escaldadura-das-folhas (Xanthomonas albilineans) é uma das principais doenças da cana-de-açúcar devido ao dano que causa e à dificuldade da sua correta identificação, especialmente quando a planta, embora infectada, não apresenta sintomas visíveis (fase latente da doença). Essa característica faz com que sua disseminação para novas áreas ocorra através do plantio de toletes aparentemente sadios. A redução na produtividade ocorre quando, em condições de stress hídrico, plantas passam a exibir sintomas crônicos e agudos da doença. Como a maioria das variedades comerciais atualmente cultivadas no Brasil são portadoras assintomáticas da doença, a correta diagnose da doença se constitui numa das principais medidas para o sucesso do controle. O presente trabalho objetivou examinar a eficiências de diferentes métodos diagnósticos de X. albilineans. Dados obtidos demonstraram que o método clássico de isolamento do patógeno em meio de cultura a partir da seiva dos internódios do colmo não foi confiável enquanto o método de amplificação por PCR detectou a bactéria em plantas com os três diferentes sintomas da doença.
Palavras-chave adicionais: Diagnose, sintoma latente, DNA, PCR, Saccharum.
A crescente conscientização dos graves problemas ambientais advindos da queima de energia fóssil faz com que todos os países do mundo procurem por fontes alternativas viáveis que possam substituir o petróleo. Nesse sentido, o Brasil se destaca por ter sucesso na substituição de uma fonte altamente poluente por uma renovável, que tem se mostrado economicamente viável graças à cana-de-açúcar. O etanol produzido da cana tem se mostrado uma alternativa confiável de substituição à gasolina nos motores automotivos, principalmente após o advento dos carros bicombustível. Some-se ainda a utilidade da cana-de-açúcar como fonte de energia, visto que após a retirada do suco (transformado posteriormente em açúcar ou etanol), o bagaço e a palha são usados na co-geração de energia fornecendo energia térmica, elétrica e mecânica, tanto para consumo da própria usina como para venda às companhias elétricas.
A demanda por etanol aumenta a cada ano devido à procura pelos carros flex, que cresce a uma proporção maior que a produção de cana-de-açúcar, fazendo com que a procura por esse tipo de carro seja maior que a produção de etanol hidratado. O açúcar também sofre uma forte valorização, pois tanto a safra brasileira, que responde por 44% do comércio mundial, como a indiana, outro grande fornecedor, sofreu redução da produção fazendo com que a perspectiva para a cana-de-açúcar do Brasil seja altamente favorável (1).
As estratégias que as usinas estão usando para atender à crescente demanda pelo produto se concentram na expansão da cultura para novas áreas e no aumento de produtividade em regiões tradicionais. A área com a cultura teve aumento significativo nos principais estados produtores na safra 2011/2012, onde S. Paulo se destacou com expansão de 203.834 ha da área existente, Minas Gerais com 152.427 ha, Goiás com 123.485 ha, Mato Grosso do Sul com 58.488 ha e Mato Grosso com 18.192 ha, totalizando 621.505 ha em todo o país (1). Esse constante incremento de novas áreas traz uma preocupação aos pesquisadores envolvidos com a cultura, pois muitas doenças importantes podem ser disseminadas através das mudas empregadas nessa expansão. Doenças como mosaico (Sugarcane mosaic virus), o raquitismo-da-soqueira (Leifsonia xyli subsp xyli), a escaldadura das folhas (Xanthomonas albilineans) e o carvão (Sporisorium scitamineum) tem nos toletes um eficiente meio de disseminação para novas áreas (8).
Dentre essas, a escaldadura das folhas é considerada uma das mais graves por afetar a qualidade do caldo da cana (9), causar morte de plantas em extensas áreas (4), estar disseminada em praticamente todas as regiões produtoras do Brasil e do mundo e ser de difícil identificação por apresentar sintoma latente (8).
A utilização de toletes provenientes de plantas doentes, porém assintomáticas faz com que a doença se dissemine facilmente para outras regiões. Uma vez plantada no campo, e sob condições de estresse climático, canas aparentemente sadias começam a apresentar sintoma agudo de escaldadura com queima das folhas, colapso súbito e morte de plantas (4). Relatos de ocorrência da doença e conseqüente dano à produtividade foram verificados nos Estados Unidos, México, Guatemala e Cuba (9).
Portanto, uma das principais medidas de controle da doença se concentra na sua correta diagnose, principalmente das canas assintomáticas, para que as mesmas possam ser descartadas antes dessas serem utilizadas como mudas. No Brasil, apesar da importância da cultura para a economia brasileira, pouca informação está disponível sobre os métodos que poderiam ser empregados para o exame diagnóstico da escaldadura-das-folhas.
Dentre os métodos de diagnose conhecidos estão o isolamento em meio de Wilbrink (8) ou meio semi-seletivo (3), sorológicos com antissoro mono ou policlonal (2) e os moleculares baseados na técnica de em PCR, com emprego de diversos conjuntos de "primers" (7,10).
Devido à falta de consenso sobre o método mais sensível de detecção da bactéria, já que para alguns pesquisadores o isolamento em meio semi seletivo se mostrou muito mais sensível que os métodos sorológicos e PCR (10), enquanto que para outros, a detecção da bactéria por isolamento em meio de cultura e sorologia a partir dos sintomas latentes não é confiável pela baixa concentração ou distribuição desigual do patógeno dentro dos tecidos da planta (2,3,6), o presente trabalho objetivou comparar o método de diagnose por isolamento do patógeno com o método baseado na amplificação de DNA total por PCR, utilizando-se de "primers" específicos.
Dez touceiras distintas do clone RB955434 com 12 meses de idade e que apresentavam perfilhos com os três tipos de sintomas de escaladadura-das-folhas foram empregadas nesse trabalho. De cada touceira foram separadas perfilhos com cada tipo de sintoma, extraindo-se, por centrifugação a 3000rpm por 15 min a seiva do internódio mais basal, mediano (quinto ou sexto entrenó) e apical (nono ou décimo entrenó).
A constatação da presença de X. albilineans foi feita por dois métodos. No método convencional, 100 µl da seiva obtida dos diferentes internódios foram espalhados na superfície da placa de Petri com Wilbrink (8) ou XAS sem inibidores (3) em três repetições para cada um dos internódios, totalizando 90 amostras para cada um dos meios de cultura. A incubação foi feita a 26º C, no escuro, por 6-7 dias, já que após esse período o crescimento das bactérias impossibilitava a individualização das mesmas. A confirmação da presença da bactéria em ambos os meios foi realizada pelo método molecular, após purificação das colônias suspeitas.
No método molecular, o DNA total foi extraído de 1,5 g de tecido dos diferentes internódios provenientes de perfilhos com os diferentes tipos de sintoma, de acordo com Murray & Thompson (5). As condições de amplificação por PCR foram realizadas segundo Pan et al. (7) utilizando-se os "primers" PGBL1 e PGBL2 propostos pelos autores. Os produtos da amplificação foram visualizados por meio de eletroforese em gel de agarose 2% e tampão 1 X de Tris-Borato-EDTA corados com brometo de etídio. Duas amostras foram empregadas como controle negativo: isolado de X. campestris pv. campestris, proveniente de couve e água milliQ autoclavada em substituição ao DNA molde. Como controles positivos também foram utilizados amostras de cultura pura de X. albilineans isolado ScXa01-01 e de seiva de uma planta com sintoma agudo de queima das folhas e brotação lateral causada pela doença.
A obtenção dos três tipos de sintomas distintos que caracterizam a escaldadura-das-folhas na cana-de-açúcar numa mesma touceira foi o diferencial que permitiu a condução deste trabalho. Esse tipo de amostragem não tinha sido empregada nos estudos realizados anteriormente (2,10) e permitiu comparar a eficiência dos diferentes métodos diagnósticos de escaldadura-das-folhas, em função dos sintomas apresentados pela planta doente.
Muitos fungos e colônias bacterianas de diferentes morfologias foram obtidos nos dois meios de cultura empregados. Das colônias bacterianas, todas aquelas semelhantes a X. albilineans, que se caracterizam por coloração amarela brilhante, convexas, bordos lisos, viscosas e não mucóides (8), foram posteriormente submetidas a diagnose molecular, o que permitiu avaliar com segurança a eficiência de cada meio de cultura em isolar a bactéria. O isolamento em meio de cultura XAS sem inibidores se mostrou mais eficiente que o de Wilbrink visto que crescimento do patógeno foi verificado em amostras de caldos advindos dos três tipos de sintomas, embora os valores da porcentagem de detacção do patógeno tenham sido distintos em função da posição do internódio no colmo e do tipo de sintoma. No entanto, nenhuma das dez amostras advindas dos colmos da região mediana da planta com sintoma latente apresentou crescimento positivo do patógeno. O meio de cultura Wilbrink teve desempenho inferior ao de XAS, não apresentando crescimento da bactéria nas amostras com sintoma latente e mesmo em plantas sintomáticas, o nível de detecção não ultrapassou 30%. Nos dois meios de cultura empregados, a recuperação da bactéria se deu de forma errática, não apresentando correlação ao tipo de sintoma e posição do internódio no colmo da planta. Em plantas com sintoma latente a porcentagem de crescimento da bactéria foi zero (meio Wilbrink) ou muito baixo (meio XAS sem inibidores) e mesmo nas sintomáticas a eficiência de detecção pode ser considerada baixa. Nenhuma tentativa de incorporação de inibidores para aumentar a eficiência desses meios foi realizada, embora o meio XAS tenha tido um desempenho superior ao de Wilbrink na detecção de X. albilineans.
Esses dados do presente trabalho estão de acordo com os observados por Comstock et al. (2). Os autores verificaram que quando o método de detecção de X. albilineans for feito através do isolamento da bactéria em meio de cultura, a posição do internódio no colmo da planta para a extração do caldo teve influência na recuperação da bactéria, apresentando portanto, baixa confiabilidade. Entretanto, segundo Davis et al. (3), em estudos realizados para avaliar métodos de isolamento e imunológicos na detecção de X. albilineans, o isolamento em meio semi-seletivo foi o método mais eficiente de detecção. Resultados semelhantes foram também descritos por Wang et al. (10).
De acordo com a literatura, os métodos imunológicos de detecção da bactéria, como ELISA ("Enzime-linked Immunosorbent Assay") e TBIA ("Tissue Blot Enzime Immunoassay") (2,3,10), também apresentam falhas, sendo que nenhum deles foi capaz de detectar a doença em 100% dos casos, mesmo em plantas sintomáticas. As razões para tal insucesso variaram desde alto nível de contaminação por outras bactérias habitantes dos vasos condutores da cana-de-açúcar (3), a distribuição desuniforme da bactéria nas diferentes partes da planta (9) e baixo título da bactéria na seiva extraída de colmos de cana com sintoma latente quando comparado com os caldos de plantas sintomáticas (3). No presente trabalho, a superioridade do método molecular ficou evidente pela detecção em 100% dos casos, independentemente do tipo de sintoma apresentado pela planta e o local de retirada da seiva no internódio da planta. Os produtos de PCR obtidos a partir de caldos advindos de colmos da parte basal, mediana e superior de plantas assintomáticas, resultaram em um fragmento específico esperado de 288 pares de bases (PB).
A crescente mecanização na cultura de cana-de-açúcar faz com que o método diagnóstico de doenças ganhe destaque e seja um dos principais requisitos para o sucesso das estratégias de controle de doenças. Isso porque o material propagativo empregado na implantação da cultura pode servir de fonte de inóculo primário de doenças que são transmitidas através de mudas contaminadas (8), especialmente a longas distâncias, em áreas novas de expansão da cultura de cana-de-açúcar, o que está ocorrendo em todas as regiões produtoras do Brasil (1). Uma vez a doença instalada na lavoura, a transmissão para outras plantas dentro do mesmo campo vai se dar especialmente através de facões e colheitadeiras (9). Nesse contexto, o presente trabalho mostrou que o método diagnóstico molecular foi eficiente em 100% das amostras de plantas doentes assintomáticas, se constituindo em ferramenta importante na detecção da escaldadura-das-folhas.
Embora a técnica BIO-PCR tenha apresentado melhores resultados que o PCR normal na detecção de escaldadura-das-folhas (10), resultados do presente estudo demonstraram que o PCR convencional pode ser o empregado pois conseguiu detectar a doença de todas as plantas assintomáticas. A técnica BIO-PCR necessita que o patógeno cresça em meio artificial por quatro dias enquanto no presente trabalho a extração do DNA do tecido foi feita em um dia, proporcionado uma rapidez na diagnose, sem gasto adicional de tempo, vidraria e reagentes.
URASHIMA, Alfredo Seiiti; ZAVAGLIA, Aline Cristine. Comparação de dois métodos diagnósticos de escaldadura-das-folhas (Xanthomonas albilineans) da cana-de-açúcar. Summa phytopathol., Botucatu, v. 38, n. 2, jun. 2012 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-54052012000200009&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-54052012000200009.
Método rápido de extração de DNA de bactérias
RESUMO
Desenvolveu-se um método rápido para extração de DNA de bactérias, que ao contrário de outros métodos, não requer o uso de enzimas, como lisozima e proteinase K, previamente, utilizado-se o carbonato de silício (carborundum) como agente físico para efetuar a quebrar da parede celular da bactéria. Com este método conseguiu-se extrair DNA bacteriano num menor tempo, além de mais rápido, ele mostrou-se mais simples e econômico, quando comparado aos métodos convencionais. O DNA obtido pode ser utilizado para diversas finalidades relacionadas ao DNA de bactérias, obtendo-se uma quantidade razoável de DNA, que varia de 725 µg/mL a 1170 µg/mL por cada 0,1 g de célula bacteriana, com ótima qualidade.
Palavras-chave adicionais: PCR, gram-positiva, gram-negativa
A parede celular das células procarióticas sempre foi uma grande vantagem para esses organismos, pois ela apresenta diversas características como elasticidade, resistência a pressão, a altas temperaturas e a valores extremos de pH. Tais características apresentam-se como um grande desafio para a biologia molecular (1). A coloração diferencial de Gram divide as bactérias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, sendo o grupo das Gram negativas em maior número para a fitopatologia. A reação das bactérias à técnica de Gram é relacionada diretamente à composição química, estrutural e a permeabilidade da parede celular (3). A parede celular das bactérias Gram-positivas é constituída de uma camada espessa composta por peptídioglicano, responsável pela sua rigidez, já nas gram-negativas, a camada de peptidioglicano é mais fina, relativamente, que consequentemente confere uma maior fragilidade (3).
Essa característica faz com que a quebra da parede celular nas gram-positivas apresente maior dificuldade, que acaba por acarretar que as técnicas utilizadas para a quebra desta parede sejam muitas vezes trabalhosas, como a ruptura celular por sonicação, auxílio de enzimas (lisozima e proteinases) tornado as técnicas mais custosa e demoradas (2).
Atualmente existe a grande necessidade de se obter técnicas baratas, rápidas e eficientes para obtenção de DNA, visto que técnicas de identificação e detecção de patógenos por PCR vêm se popularizando cada vez mais. Este trabalho teve por objetivo avaliar um método de extração de DNA pela quebra da parede celular, utilizando-se da ação mecânica, causada por carbonato de silício (Carborundum), produto que apresenta granulométria entorno de 320 mm e é quimicamente inerte. Carborundum ou carbonato de silício é um produto abrasivo muito utilizado na fitopatologia para efetuar pequenos ferimentos, os quais viabilizam a infecção por vírus artificialmente.
Culturas bacterianas foram desenvolvidas em tubos do tipo Falconâ, contendo 10 mL de meio de cultura Nutriente Líquido (1g extrato de carne, 2g extrato de levedura, 5g peptona, 5g NaCl, 5g dextrose, 1000 ml água destilada esterilizada) por 24 horas, a 28ºC, sobre agitação constante a 110 rpm. Após este período, as culturas foram centrifugadas a 5000 g por 30 minutos, descartando-se o sobrenadante e obtendo-se um precipitado, o qual foi ressuspendido em 1 mL de tampão de extração (20 mM Tris pH 7.5, 25 mM EDTA, 75 mM NaCl e 1/10 volume de SDS 10% ) (4). O volume obtido foi transferido para um microtubo de 1,7 mL, no qual foi acrescido de 0,2 gramas de carbonato de silício. Uma massa de 10 gramas de carbonato de silício foi previamente tratada com uma solução de 50 mL de ácido clorídrico 10M, por 2 horas a temperatura de 30ºC, seguida de lavagem continua por 12 horas com água destilada, e posteriormente foi autoclavado a 120ºC por 20 minutos e seco em estufa a 70ºC por 24 horas. O microtubo contendo tampão de extração mais células bacterianas e o carbonato de silício foi agitado em aparelho tipo "vortex" a 2000 rpm por 2 minutos, para romper a parede celular.
Os tubos foram incubação por 30 minutos, a 50ºC, após este período, acrescentou-se 2/3 do volume de NaCl 5 M e, deixou-se, por 30 minutos, a 4ºC. Centrifugou-os por 10 minutos, a 10.000 g, transferiu-se o sobrenadante para novos microtubos de 1,7 mL e adicionou-se 1 volume de clorofórmio, misturou-se vagarosamente e centrifulgou-se, por 10 minutos, a 10.000g. Transferiu-se a parte aquosa obtida para um novo microtubo de 1,7 mL e adicionou-se um volume de isopropanol e incubou-o em temperatura ambiente, por 5 minutos, procedendo em seguida um centrifugação durante 10 minutos, a 10.000g, sendo descartado o sobrenadante e o precipitado obtido (DNA) foi seco à temperatura ambiente, durante 5 minutos, e então adicionou-se 40 µL de TE pH:8,0 + RNAse 10µg/µL ao tubo e esse foi incubado por 60 minutos a 37ºC.
Após a extração, cada amostra de DNA teve sua concentração e pureza determinadas através das leituras de absorbância em 260 nm (Concentração do DNA em µmg/ml = Absx100x50) (4) e em 280 nm (quantificação de proteínas), no espectrofotômetro Ultrospec 3100 pro (Amershan Pharmacia Biotech). A razão entre as leituras em 260 nm e 280 nm foi utilizada como um indicativo da pureza do DNA obtido. A eletroforese para verificação da qualidade do DNA extraído foi realizada em gel de agarose 0,8%. A esse gel foi aplicada uma amostra de cada um dos microtubos (3 µl de água Milli-Q, 1 µl de corante azul de bromofenol e 2 µl da solução de DNA). Utilizou-se como padrão de comparação marcador Lambda (λ), nas concentrações de 100 e 200 ng/mL. Após 50 minutos em eletroforese a 90 voltz, o gel foi tratado com SYBR Safe™ DNA Gel Stain (Invitrogen Corporation), conforme instrução do fabricante, e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Procedeu-se também uma reação de polimerase em cadeia (PCR) do gene ribossomal 16S dos DNAs extraídos, o qual foi amplificado utilizando-se oligonucleotídeos universais (968 forward: AAC GCG AAG AAC CTT AC; 1401 reverse: CGG TGT GTA CAA GAC CC) (4). A PCR foi realizada utilizando 1,0 ìl de DNA, 10,0 pmol de cada oligonucleotídeo, 10 mM de dNTPs, 25 mM de MgCl2, 2,5 µl de PCR Buffer 10x e 1U de Taq DNA Polimerase (Fermentas Life Science) para um volume final de 25 µl. A PCR foi realizada sob as seguintes condições: aquecimento inicial a 95ºC, por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 95ºC, por 30 segundos, anelamento do oligonucleotídeo a 57ºC, por 30 segundos, e alongamento a 72ºC, por 1 minuto. Um alongamento final de 5 minutos foi realizado após os ciclos. Os produtos amplificados, de aproximadamente 430pb, foram examinados por eletroforese em gel de agarose a 1%, com 5 Volts/cm, por 40 minutos. O gel foi corado com SYBR Safe™ DNA Gel Stain (Invitrogen Corporation) e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Para verificar a degradação dos DNA extraído efetuou-se uma análise utilizando-se de gel de agarose 1% em eletroforese de campo pulsado, com 6 Volts/cm, ciclos de 25 por 35, por 12 horas de corrida e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Na análise do DNA por espectrofotometria mostrou uma boa qualidade deste. Baseado nos valores da razão da absorbância de 260nm/280nm mostrou que o DNA obtido estava de boa qualidade e com baixas concentrações de proteínas e de RNA . A análise da extração do DNA em gel de agarose mostrou que a quantidade de quebra de DNA foi pequena, obtendo-se uma banda bem visível com pouco sinal de degradação e com boa quantidade extraída quando efetuada a análise quantitativa do DNA em relação ao marcadorλ.
A quantificação por espectrofotometria mostrou que as concentrações dos DNAs extraídos variaram de 785 µg/mL a 1170 µg/ml. Na estimativa de rendimento da extração, relativa a uma massa de célula bacteriana de 0,1 grama, de células de E. coli, obteve-se uma concentração de 725 µg/mL, que representa um rendimento de 29µg de DNA, ou seja, 290 µg de DNA/g de célula de E. coli.
A análise para verificar a integridade do DNA utilizou-se a reação de PCR, com os oligonucleotídeos amplificadores da região do 16S rDNA, obtendo-se um fragmento de 430 pares de base, esta amplificação mostrou que o DNA está integro, confiável para estudos utilizando-se de PCR a partir de DNA extraído por este método.
Para comprovar a possibilidade da utilização do DNA extraído, por este método, para técnicas mais refinadas, como clonagem de grandes fragmentos de DNA em vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosomal), efetuou-se a análise dos DNAs extraídos em eletroforese de campo pulsado por 11 horas, que mostrou uma fragmentação do DNA aceitável, apresentando fragmentos que variaram de 48.500 pares de base a 291.000 pares de base, mostrando assim que é viável a utilização desta técnica para construção de BACs (Dados não apresentados).
O método de extração utilizando carbonato de silício como ferramenta para romper a parede celular de bactérias gram-positivas e gram-negativas, visando a extração de DNA, mostrou-se eficiente, apresentando resultados satisfatórios quando comparados com os métodos descritos na literatura (2) e de baixo custo, quando comparado com os métodos tradicionais (2).
ROSA, Daniel Dias. Método rápido de extração de DNA de bactérias. Summa phytopathol., Botucatu, v. 34, n. 3, set. 2008 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-54052008000300011&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-54052008000300011.
Desenvolveu-se um método rápido para extração de DNA de bactérias, que ao contrário de outros métodos, não requer o uso de enzimas, como lisozima e proteinase K, previamente, utilizado-se o carbonato de silício (carborundum) como agente físico para efetuar a quebrar da parede celular da bactéria. Com este método conseguiu-se extrair DNA bacteriano num menor tempo, além de mais rápido, ele mostrou-se mais simples e econômico, quando comparado aos métodos convencionais. O DNA obtido pode ser utilizado para diversas finalidades relacionadas ao DNA de bactérias, obtendo-se uma quantidade razoável de DNA, que varia de 725 µg/mL a 1170 µg/mL por cada 0,1 g de célula bacteriana, com ótima qualidade.
Palavras-chave adicionais: PCR, gram-positiva, gram-negativa
A parede celular das células procarióticas sempre foi uma grande vantagem para esses organismos, pois ela apresenta diversas características como elasticidade, resistência a pressão, a altas temperaturas e a valores extremos de pH. Tais características apresentam-se como um grande desafio para a biologia molecular (1). A coloração diferencial de Gram divide as bactérias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, sendo o grupo das Gram negativas em maior número para a fitopatologia. A reação das bactérias à técnica de Gram é relacionada diretamente à composição química, estrutural e a permeabilidade da parede celular (3). A parede celular das bactérias Gram-positivas é constituída de uma camada espessa composta por peptídioglicano, responsável pela sua rigidez, já nas gram-negativas, a camada de peptidioglicano é mais fina, relativamente, que consequentemente confere uma maior fragilidade (3).
Essa característica faz com que a quebra da parede celular nas gram-positivas apresente maior dificuldade, que acaba por acarretar que as técnicas utilizadas para a quebra desta parede sejam muitas vezes trabalhosas, como a ruptura celular por sonicação, auxílio de enzimas (lisozima e proteinases) tornado as técnicas mais custosa e demoradas (2).
Atualmente existe a grande necessidade de se obter técnicas baratas, rápidas e eficientes para obtenção de DNA, visto que técnicas de identificação e detecção de patógenos por PCR vêm se popularizando cada vez mais. Este trabalho teve por objetivo avaliar um método de extração de DNA pela quebra da parede celular, utilizando-se da ação mecânica, causada por carbonato de silício (Carborundum), produto que apresenta granulométria entorno de 320 mm e é quimicamente inerte. Carborundum ou carbonato de silício é um produto abrasivo muito utilizado na fitopatologia para efetuar pequenos ferimentos, os quais viabilizam a infecção por vírus artificialmente.
Culturas bacterianas foram desenvolvidas em tubos do tipo Falconâ, contendo 10 mL de meio de cultura Nutriente Líquido (1g extrato de carne, 2g extrato de levedura, 5g peptona, 5g NaCl, 5g dextrose, 1000 ml água destilada esterilizada) por 24 horas, a 28ºC, sobre agitação constante a 110 rpm. Após este período, as culturas foram centrifugadas a 5000 g por 30 minutos, descartando-se o sobrenadante e obtendo-se um precipitado, o qual foi ressuspendido em 1 mL de tampão de extração (20 mM Tris pH 7.5, 25 mM EDTA, 75 mM NaCl e 1/10 volume de SDS 10% ) (4). O volume obtido foi transferido para um microtubo de 1,7 mL, no qual foi acrescido de 0,2 gramas de carbonato de silício. Uma massa de 10 gramas de carbonato de silício foi previamente tratada com uma solução de 50 mL de ácido clorídrico 10M, por 2 horas a temperatura de 30ºC, seguida de lavagem continua por 12 horas com água destilada, e posteriormente foi autoclavado a 120ºC por 20 minutos e seco em estufa a 70ºC por 24 horas. O microtubo contendo tampão de extração mais células bacterianas e o carbonato de silício foi agitado em aparelho tipo "vortex" a 2000 rpm por 2 minutos, para romper a parede celular.
Os tubos foram incubação por 30 minutos, a 50ºC, após este período, acrescentou-se 2/3 do volume de NaCl 5 M e, deixou-se, por 30 minutos, a 4ºC. Centrifugou-os por 10 minutos, a 10.000 g, transferiu-se o sobrenadante para novos microtubos de 1,7 mL e adicionou-se 1 volume de clorofórmio, misturou-se vagarosamente e centrifulgou-se, por 10 minutos, a 10.000g. Transferiu-se a parte aquosa obtida para um novo microtubo de 1,7 mL e adicionou-se um volume de isopropanol e incubou-o em temperatura ambiente, por 5 minutos, procedendo em seguida um centrifugação durante 10 minutos, a 10.000g, sendo descartado o sobrenadante e o precipitado obtido (DNA) foi seco à temperatura ambiente, durante 5 minutos, e então adicionou-se 40 µL de TE pH:8,0 + RNAse 10µg/µL ao tubo e esse foi incubado por 60 minutos a 37ºC.
Após a extração, cada amostra de DNA teve sua concentração e pureza determinadas através das leituras de absorbância em 260 nm (Concentração do DNA em µmg/ml = Absx100x50) (4) e em 280 nm (quantificação de proteínas), no espectrofotômetro Ultrospec 3100 pro (Amershan Pharmacia Biotech). A razão entre as leituras em 260 nm e 280 nm foi utilizada como um indicativo da pureza do DNA obtido. A eletroforese para verificação da qualidade do DNA extraído foi realizada em gel de agarose 0,8%. A esse gel foi aplicada uma amostra de cada um dos microtubos (3 µl de água Milli-Q, 1 µl de corante azul de bromofenol e 2 µl da solução de DNA). Utilizou-se como padrão de comparação marcador Lambda (λ), nas concentrações de 100 e 200 ng/mL. Após 50 minutos em eletroforese a 90 voltz, o gel foi tratado com SYBR Safe™ DNA Gel Stain (Invitrogen Corporation), conforme instrução do fabricante, e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Procedeu-se também uma reação de polimerase em cadeia (PCR) do gene ribossomal 16S dos DNAs extraídos, o qual foi amplificado utilizando-se oligonucleotídeos universais (968 forward: AAC GCG AAG AAC CTT AC; 1401 reverse: CGG TGT GTA CAA GAC CC) (4). A PCR foi realizada utilizando 1,0 ìl de DNA, 10,0 pmol de cada oligonucleotídeo, 10 mM de dNTPs, 25 mM de MgCl2, 2,5 µl de PCR Buffer 10x e 1U de Taq DNA Polimerase (Fermentas Life Science) para um volume final de 25 µl. A PCR foi realizada sob as seguintes condições: aquecimento inicial a 95ºC, por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 95ºC, por 30 segundos, anelamento do oligonucleotídeo a 57ºC, por 30 segundos, e alongamento a 72ºC, por 1 minuto. Um alongamento final de 5 minutos foi realizado após os ciclos. Os produtos amplificados, de aproximadamente 430pb, foram examinados por eletroforese em gel de agarose a 1%, com 5 Volts/cm, por 40 minutos. O gel foi corado com SYBR Safe™ DNA Gel Stain (Invitrogen Corporation) e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Para verificar a degradação dos DNA extraído efetuou-se uma análise utilizando-se de gel de agarose 1% em eletroforese de campo pulsado, com 6 Volts/cm, ciclos de 25 por 35, por 12 horas de corrida e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Na análise do DNA por espectrofotometria mostrou uma boa qualidade deste. Baseado nos valores da razão da absorbância de 260nm/280nm mostrou que o DNA obtido estava de boa qualidade e com baixas concentrações de proteínas e de RNA . A análise da extração do DNA em gel de agarose mostrou que a quantidade de quebra de DNA foi pequena, obtendo-se uma banda bem visível com pouco sinal de degradação e com boa quantidade extraída quando efetuada a análise quantitativa do DNA em relação ao marcadorλ.
A quantificação por espectrofotometria mostrou que as concentrações dos DNAs extraídos variaram de 785 µg/mL a 1170 µg/ml. Na estimativa de rendimento da extração, relativa a uma massa de célula bacteriana de 0,1 grama, de células de E. coli, obteve-se uma concentração de 725 µg/mL, que representa um rendimento de 29µg de DNA, ou seja, 290 µg de DNA/g de célula de E. coli.
A análise para verificar a integridade do DNA utilizou-se a reação de PCR, com os oligonucleotídeos amplificadores da região do 16S rDNA, obtendo-se um fragmento de 430 pares de base, esta amplificação mostrou que o DNA está integro, confiável para estudos utilizando-se de PCR a partir de DNA extraído por este método.
Para comprovar a possibilidade da utilização do DNA extraído, por este método, para técnicas mais refinadas, como clonagem de grandes fragmentos de DNA em vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosomal), efetuou-se a análise dos DNAs extraídos em eletroforese de campo pulsado por 11 horas, que mostrou uma fragmentação do DNA aceitável, apresentando fragmentos que variaram de 48.500 pares de base a 291.000 pares de base, mostrando assim que é viável a utilização desta técnica para construção de BACs (Dados não apresentados).
O método de extração utilizando carbonato de silício como ferramenta para romper a parede celular de bactérias gram-positivas e gram-negativas, visando a extração de DNA, mostrou-se eficiente, apresentando resultados satisfatórios quando comparados com os métodos descritos na literatura (2) e de baixo custo, quando comparado com os métodos tradicionais (2).
ROSA, Daniel Dias. Método rápido de extração de DNA de bactérias. Summa phytopathol., Botucatu, v. 34, n. 3, set. 2008 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-54052008000300011&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-54052008000300011.
Caracterização patogênica e molecular de Plasmodiophora brassicae
RESUMO
Poucos estudos foram desenvolvidos no Brasil sobre a doença hérnia das crucíferas, causada por Plasmodiophora brassicae. Realizou-se testes de severidade da doença causada por diferentes populações do patógeno em espécies de brássicas (couve-flor, couve-chinesa suscetível, couve-chinesa resistente, brócolis e repolho). As populações de P. brassicae foram obtidas de raízes de brássicas infectadas originárias de algumas regiões produtoras no Brasil. Os testes de severidade foram realizados em casa de vegetação (25±2ºC) mediante inoculações, no colo de cada planta com 2 mL da suspensão de esporos do patógeno, na concentração de 107 esporos mL-1. As avaliações ocorreram 35 dias após a inoculação. Em laboratório foi realizada a extração de DNA dessas populações e análises de PCR-RAPD para a comparação das características genéticas. As populações obtidas nas regiões de Carandaí MG e Colombo PR mostraram-se mais agressivas, manifestando patogenicidade até mesmo em cultivar considerada resistente. Entretanto, não foi observado um padrão genético específico quanto ao local de origem das populações avaliadas, sugerindo que mesmo em locais distantes e com diferenças quanto à severidade, tais populações são geneticamente semelhantes.
Palavras chaves: hérnia das crucíferas, PCR, patógeno de solo, Brassicaceae.
INTRODUÇÃO
Plasmodiophora brassicae Woronin é o patógeno responsável pela doença popularmente conhecida como hérnia das crucíferas (HDC), uma das mais importantes nas regiões produtoras de brássicas no mundo. Esta doença, característica de regiões de temperaturas amenas, em torno de ± 20ºC, vem ganhando expressão em áreas agrícolas tradicionalmente cultivadas com brássicas no Brasil. Uma vez presente no solo, as estruturas de resistência do patógeno podem sobreviver por mais de 15 anos (Wallenhammar, 1996), o que dificulta seu controle.
Em decorrência da dificuldade de seu isolamento, por se tratar de um parasita obrigatório, pouco se sabe sobre seu desenvolvimento em condições brasileiras de cultivo, o que explica a existência de maior número de trabalhos que avaliam o comportamento de populações de P. brassicae, como os realizados por Ito et al. (1999b) e Murakami et al. (2000) no Japão, quando comparados aos que utilizam isolados monospórico, como o realizado por Manzanares-Dauleux et al. (2001) na França. Alguns trabalhos relatam a existência de populações heterogêneas do patógeno em uma mesma área, podendo algumas estruturas de resistência serem patogênicas e outras não, sendo esta uma das maiores dificuldades metodológicas com quem trabalha com P. brassicae (Diederichsen et al., 1996). A forma mais recomendada de controle da HDC é a utilização de cultivares com maior nível de resistência, pois é considerada a maneira mais eficiente e econômica. Mas para que essa resistência a doença seja mantida, é fundamental o entendimento da diversidade do patógeno e os fatores que interferem na sua agressividade em condições ambientais brasileiras.
Pouco se sabe sobre a agressividade das populações brasileiras de P. brassicae, mas alguns trabalhos realizados em outros países trazem algumas importantes informações, principalmente com relação à observação de diferenças significativas existentes entre populações heterogêneas, como as obtidas na Austrália (Crute et al., 1983), Japão (Kuginuki et al., 1999) e Escócia (Jones et al., 1982a), bem como de isolados monospóricos, realizados por Somé et al. (1996) na França e Klever et al. (2001) na Alemanha. Para complementar as informações obtidas a campo sobre P. brassicae, a utilização de métodos moleculares pode permitir tanto a detecção precoce do patógeno no hospedeiro ou no solo, bem como a diferenciação de patótipos. Além disso, pode possibilitar melhor compreensão da relação entre P. brassicae e diferentes hospedeiros, visando o desenvolvimento de estratégias apropriadas de controle.
Parsons et al. (2003) e Faggian et al. (2003) conseguiram extrair o DNA das estruturas de repouso de P. brassicae de isolados encontrados em solos australianos, e utilizaram esse DNA extraído para análises de PCR. Desta maneira, obtiveram uma metodologia de detecção do patógeno antes do cultivo do hospedeiro. Entretanto, os autores ressaltam que a técnica não é viável quando existem baixas concentrações das estruturas de repouso no solo. Ito et al. (1999a) também demonstraram a viabilidade do uso da técnica de PCR para o estudo genético do DNA de P. brassicae, extraído de estruturas de repouso do patógeno encontrados em solos, e de estruturas presentes nos tecidos de hospedeiros (Ito et al., 1999b). Este trabalho teve como objetivo a avaliação da patogenicidade e severidade de alguns isolados (populações) brasileiros de P. brassicae, coletados a campo, bem como a caracterização molecular desses isolados, na tentativa de se obter maiores informações que possam favorecer o controle da doença e o desenvolvimento de novas cultivares resistentes.
MATERIAL E MÉTODOS
Isolados de Plasmodiophora brassicae
Raízes de brássicas apresentando sintomas de hérnias, naturalmente infectadas por P. brassicae, foram coletadas de áreas agrícolas brasileiras e analisadas no laboratório de Fitopatologia da Faculdade de Ciências Agronômicas, Departamento de Produção Vegetal/Defesa Fitossanitária, UNESP, Botucatu, SP, onde foram congeladas em freezer comum antes de serem utilizadas (Cruz et al., 2009). Destes materiais, onze isolados (populações) foram selecionados e catalogados conforme local, data de coleta e hospedeiro.
Teste de Patogenicidade
Dois ensaios foram conduzidos nos períodos de junho a setembro (ensaio I) e agosto a outubro (ensaio II) de 2006. Para tanto, os onze isolados foram multiplicados em mudas de couve-chinesa (Brassica rapa var. pekinensis), de uma cultivar suscetível ao patógeno (Pak choi), para que suas estruturas de repouso fossem ativadas após os períodos de armazenamento em freezer. Mudas de couve-flor (B. oleraceae var. botrytis), cultivar Sharon; brócolis (B. oleracea L. var. italica) cultivar Ramoso Santana; repolho (B. oleracea var. capitata) cultivar Kenzan; couve-chinesa - cultivar suscetível (B. rapa var. pekinensis) Pak choi; couve-chinesa - cultivar resistente (B. rapa var. pekinensis) Komachi, com quatro semanas de semeadura foram transplantadas para vasos com capacidade de 1,7L, contendo solo estéril, inoculadas e irrigadas, quando necessário. Os ensaios foram mantidos em condições parcialmente controladas de casa de vegetação (±25ºC), nas dependências do Departamento de Produção Vegetal/Defesa Fitossanitária da FCA-UNESP, Botucatu (SP), conduzidos em diferentes períodos: I: 28/07/06 a 01/09/06; II: 25/09/06 a 30/10/06.
Para a inoculação, 10 gramas de raízes, mostrando sintomas típicos de hérnias foram trituradas em liquidificador, por um minuto, com 200 mL de água destilada. Entre as triturações dos diferentes isolados, o copo do liquidificador foi desmontado e desinfestado por lavagem em água corrente com detergente comum, depois em solução de álcool a 70%, por 1 minuto, solução de hipoclorito de sódio a 2% por 1 minuto, e finalmente, enxaguado em água corrente. As suspensões obtidas foram filtradas em camadas de gaze para a retirada de fragmentos de raízes e a concentração de inóculo ajustada com o auxílio de hemacitômetro. Em seguida foram feitas inoculações no colo de cada planta, com 2 mL da suspensão de esporos de P. brassicae, na concentração de 107 esporos mL-1.
Cada tratamento contou com seis repetições, onde cada repetição foi composta de um vaso com uma planta, distribuídas em blocos ao acaso. Passadas cinco semanas após a inoculação, as raízes foram lavadas e avaliadas. Para tanto foi utilizada uma escala visual de notas variando de 0 a 4 (0=0%, 1=25%, 2=50%, 3=75% e 4=100%), conforme a porcentagem da área radicular afetada (Takahashi et al., 2005). Os dados foram submetidos à análise de variância não paramétrica de Kruskal-Wallis, para o modelo com dois fatores em blocos completos, sendo os tratamentos distribuídos de forma casual, quanto ao hospedeiro e local de origem, complementada com o respectivo teste de comparações múltiplas (Zar, 1999), obtendo-se dessa maneira a mediana e semi-amplitude total da severidade da doença causada por P. brassicae, para cada isolado em diferentes hospedeiros de cada ensaio. Raízes dos hospedeiros que apresentaram sintomas de hérnias e nota igual ou acima de 1 (aproximadamente 25% da área radicular afetada) foram considerados suscetíveis aos isolados testados.
Extração de DNA
O DNA dos isolados de P. brassicae foi obtido mediante suspensões de esporos, onde 10g de raízes contendo sintomas de HDC de cada isolado foram trituradas em liquidificador, com 50 mL de água destilada esterilizada por 1 minuto, para que a suspensão ficasse concentrada. Posteriormente, essa suspensão foi filtrada em dez camadas de gaze e acondicionada em microtubos com capacidade de 1000µL, sendo então precipitada por centrifugação a 2.500g, durante 10 minutos, repetindo a operação quatro vezes.
O sobrenadante obtido foi descartado das amostras. Adicionou-se, em seguida, 700 µL da solução I (100mM MgCl2; 200mM Tris-HCl pH 7,4; 30 µg mL-1 DNAse) que foi incubada a 37ºC em "banho maria" por 3 horas, este passo é imprescindível para eliminação do DNA do hospedeiro, o qual poderia interferir nas análises. Em seguida, efetuou-se a centrifugação por 2.500g, durante cinco minutos e descartou-se o sobrenadante. Os precipitados foram então ressuspendidos em 700µL da solução II (5mM EDTA; 0,5% SDS; 10mM Tris-HCl pH 7,8; 20 µg mL-1 de proteinase K) e incubado a 37ºC, por 30 minutos, e novamente centrifugado por 2.500g durante cinco minutos sendo o sobrenadante novamente descartado (Manzanarez-Daulex et al., 2001).
O DNA foi extraído de acordo com o protocolo CTAB modificado (Doyle & Doyle, 1990) adicionando-se 300µL de tampão de extração (2% CTAB; 1,4M NaCl; 20mM EDTA; 100mM Tris-Cl pH 7,8; 0,2% mercaptoetanol) e incubado por 30 minutos, a 65ºC. O material obtido foi centrifugado a 1.100g por 1 minuto, e o sobrenadante, transferido para um novo tubo.
O mesmo volume (300µL) da mistura de clorofórmio e álcool isoamílico (CIA 24:1) foi adicionado e homogeneizado em vortex, em seguida, centrifugou-se a 1.100g por 2 minutos. A fase superior, aproximadamente 500 µL, foi transferida para novo tubo. O DNA foi precipitado com 2/3 do volume de isopropanol gelado e mantido no gelo por 30 minutos, então submetido à centrifugação por 15 minutos, a 1.100g.
O sobrenadante foi descartado e, ao precipitado, adicionado 1 mL de álcool 70% sendo centrifugado por 10 minutos a 1.100g. O sobrenadante foi novamente descartado, e o precipitado permaneceu secando a temperatura ambiente, por aproximadamente 15 minutos. Depois esse precipitado foi dissolvido em 20 µL de TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA) e 20 µg mL-1 de RNAse sendo, em seguida, deixado a 37ºC, por 12 horas.
PCR-RAPD
Para as reações de PCR-RAPD, segundo Manzanares-Dauleux et al. (2001) modificado, o DNA de cada material foi quantificado em espectofotômetro, determinando-se a razão A260/A280 de todas as amostras de DNA para verificar a pureza dos ácidos nucléicos. A solução estoque de DNA foi diluída em uma concentração final de 5ng/µL e estocada em freezer a -20ºC, para que o DNA não fosse degradado, sendo posteriormente descongelada para a realização das análises de RAPD.
Em testes preliminares foram selecionados 12 primers arbitrários, obtidos da Operon Technologies Inc. (Alameda, CA, USA), sendo eles: OPB-10 (CTGCTGGGAC), OPA-2 (TGCCGAGCTG), OPP-7 (GTCCATGCCA), OPP-10 (TCCCGCCTAC), OPA-3 (AGTCAGCCAC), OPG-13 (CTCTCCGCCA), OPA-7 (GAAACGGGTG), OPP-13 (GGAGTGCCTC), OPF-13 (GGCTGCAGAA), OPA-10 (GTGATCGCAG), OPA-13 (CAGCACCCAC) e OPC-16 (CACACTCCAG), que permitiram a melhor visualização do padrão de fragmentos gerados pela amplificação de DNA de P. brassicae.
Cada reação de PCR-RAPD foi composta de 7,5 µL de DNA genômico (1ng/µL) e 22,5 µL de solução mix de reação [(7,45 µL de água ultra pura esterilizada, 3,0 µL de solução tampão, 2,4 µL de dNTP, 9,2 µL de cada um dos "primers" descritos acima e 0,45 unidades de Taq polymerase (Invitrogen, Groningen, Holanda)], totalizando 30 µL em tubos de PCR com capacidade de 200 µL. O DNA foi substituído pelo mesmo volume de água ultra pura esterilizada para servir como controle.
A amplificação foi realizada em termociclador PTC-100 (MJ Research Inc., Waterown, MA), programado para iniciar o ciclo de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, seguido de 45 ciclos de 30 segundos a 92ºC, 1 minuto a 35ºC e 2 minutos e 30 segundos a 72ºC, com extensão final de 72ºC por 5 minutos. Os produtos de RAPD foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,5% e TBE 1X , a 4V/cm de gel, onde foram utilizados 10 µL do material da reação misturados com 5 µL de tampão de carregamento (0,25 % de azul de bromofenol e 40% de sacarose) (Sambrook et al., 1987) e 5 µL de marcador 1kb, também misturados com 5 µL de tampão de carregamento. Posteriormente, as bandas foram visualizadas e fotografadas sob luz ultravioleta em Eagle Eye II (Stratagene).
Os dados foram registrados na forma de ausência/presença das bandas no gel. Bandas de mesmo comprimento foram consideradas como idênticas. Estes dados foram codificados na forma binária (1 para presença e 0 para ausência). A distância genética entre os isolados de P. brassicae foi determinada pelo coeficiente de similaridade de Nei & Li (1979). A matriz de similaridade foi, em seguida, transformada em um dendrograma não enraizado, utilizando-se o método SAHN Clustering (Sequential Agglomerative, Hierarchical and Nested) sob procedimento UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averaging), no programa PAUP* (version 4.0b5a) (Swofford, 2002).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos onze isolados analisados, nove foram patogênicos à cultivar de couve-chinesa suscetível (Pak choi) no ensaio I, realizado no período de junho a setembro de 2006, e dois isolados não foram patogênicos, os isolados 3 (Piedade-SP) e 6 (Colombo 2-PR) . No ensaio II todos os isolados foram altamente agressivos para esta cultivar. Embora o isolado 3 não tenha sido patogênico no ensaio I, no ensaio II este isolado foi patogênico para couve-flor, couve-chinesa suscetível e repolho, e o isolado 6, somente para a cultivar de couve-chinesa suscetível neste mesmo ensaio, o que pode indicar certa preferência destes isolados para se desenvolverem em períodos que tendem a ser mais quentes do ano (setembro a outubro).
Os diferentes resultados podem ser atribuídos ao efeito do ambiente e adaptação dos isolados às condições climáticas de cultivo ocorridas no ensaio II (meses de setembro a outubro de 2006), provavelmente devido ao maior comprimento do dia e intensidade luminosa encontrada nessa época do ano, quando comparado ao ensaio I. Os fatores ambientais não controlados na casa de vegetação utilizada podem ter deixado os hospedeiros mais propensos às infecções para esses isolados. A severidade de P. brassicae é resultado da interação do genótipo do hospedeiro com o genótipo do patógeno e as condições de cultivo, onde plantas altamente suscetíveis que estão em condições de cultivo adversas, podem ser infectadas por um isolado que não é altamente agressivo e desenvolverem os sintomas, reforçando o conceito clássico de doenças.
Em contraste, um hospedeiro altamente resistente requer um isolado altamente agressivo e condições de campo ótimas para o desenvolvimento do patógeno para que ocorra o desenvolvimento da doença. Esta é a possível explicação para as diferentes reações patogênicas nas duas épocas de desenvolvimento do ensaio, visto que os hospedeiros apresentaram menor desenvolvimento da doença no ensaio II, onde o clima pode ter favorecido o desenvolvimento dos hospedeiros e prejudicado o dos isolados.
O efeito contrário foi observado no ensaio I, cultivado nos meses de julho a setembro, onde a maioria dos isolados de P. brassicae foi mais agressiva, pois o patógeno provavelmente foi favorecido pelo ambiente de cultivo, embora o solo utilizado neste ensaio tenha apresentado maiores índices médios de matéria orgânica e cálcio que o solo utilizado no ensaio II, o que poderia ter proporcionado sua supressividade (Niwa et al., 2007).
Os isolados 1 (Carandaí-MG), 8 (Colombo 4-PR) e 9 (Colombo 5-PR) mostraram-se patogênicos para a cultivar de couve-chinesa considerada resistente (Komachi) nos dois ensaios, mostrando que esses isolados foram capazes de quebrar a resistência inicial dessa cultivar independentemente do ambiente de cultivo. Os isolados 5 (Colombo 1-PR) e 7 (Colombo 3-PR) somente foram patogênicos em condições climáticas encontradas no ensaio I. Isto mostra que não seria prudente a indicação, da referida cultivar, para o plantio na região de Colombo-PR, independentemente da época de cultivo, e para a região de Carandaí-MG, no período de inverno brasileiro, pois pressupõe-se que nestas regiões de cultivo existam isolados altamente agressivos que podem causar o desenvolvimento da HDC nessa cultivar de couve-chinesa .
No ensaio I, mais isolados mostraram-se patogênicos para repolho, como por exemplo, 1, 2 5, 7, 8 e 9, diferindo dos dados obtidos no ensaio II, onde apenas os isolados 3 e 11 foram capazes de promover a formação de hérnias. O mesmo também foi observado para a cultivar utilizada de brócolis, no ensaio I, onde os isolados 1, 5, 8, 9 e 10 provocaram a formação de hérnias. Já no ensaio II, apenas o isolado 9 mostrou-se patogênico a brócolis, indicando ser altamente suscetível a esse isolado (Colombo 5-PR). Portanto esta cultivar de brócolis (Ramoso Santana) não deve ser recomendada para o cultivo na região de Colombo-PR. Os resultados mostram que de maneira geral, os isolados de Carandaí-MG e os da região de Colombo-PR apresentaram maior severidade, dentro dos ensaios desenvolvidos para os diferentes hospedeiros, quando comparados aos isolados coletados no Estado de São Paulo.
Para os demais hospedeiros, a patogenicidade dos isolados não foi uniforme, já que para couve-flor, no ensaio I foram patogênicos os isolados 1, 8 e 9, já no ensaio II, apenas o isolado 3 causou sintomas, que não havia se mostrado patogênico no ensaio anterior. Estas variações são compreensíveis, visto que cada população pode apresentar estruturas de repouso com diferentes graus de severidade, podendo desenvolver a doença conforme as condições ambientais presentes em determinados momentos (Williams, 1966).
Algumas repetições, dentro de cada parcela para determinados isolados com menor severidade, apresentaram plantas com formação de hérnias nos ensaios I e II, indicando que estes isolados podem apresentar potencial de desenvolvimento da doença, dependendo do ambiente de cultivo utilizado, como mostram os isolados: 10 para couve-flor; 4 para repolho e os 2 e 7 para brócolis no ensaio I e os isolados 1, 4, 6, 7, 9, 10 e 11 para couve-flor; 5 e 7 para couve-chinesa Komachi (resistente); 2, 4, 6, 7, 8 e 9 para repolho e os 3, 4, 6 e 7 para brócolis no ensaio II.
Muitos estudos desenvolvidos com P. brassicae utilizaram linhas de hospedeiros diferenciadores da European Clubroot Differential (ECD) como referenciais em trabalhos similares a este. Entretanto, Kuginuki et al. (1999) comparando os hospedeiros da ECD e os utilizados por Williams (1966) em cultivares japonesas, com relação a populações de P. brassicae, verificaram que esses hospedeiros diferenciais (ECD) não classificaram claramente 36 populações japonesas quanto à patogenicidade. Esses autores relatam que os resultados dependem da pureza genética das cultivares e que o ideal, para este tipo de estudo, ainda são os materiais oriundos de isolamentos monospóricos, que apresentam maior homogeneidade genética.
Este tipo de isolamento, entretanto, pode apresentar baixa porcentagem infectiva, provavelmente em decorrência da variabilidade genética dos isolados coletados a campo, como no trabalho desenvolvido por Somé et al. (1996), que obteve aproximadamente 10% das mudas inoculadas monosporicamente com sintomas. Jones et al. (1982b) também se depararam com a mesma problemática, pois apenas três plantas de B. campestris var. pekinensis cv Granaat (suscetível) apresentaram hérnias quando inoculadas monosporicamente, considerando-se as 450 inoculadas menos de 1% de sucesso foi obtido utilizando esta técnica.
Donald et al. (2006) também observaram a interferência das condições climáticas de cultivo no desenvolvimento de sintomas em linhas diferenciadoras da ECD (European Clubroot Differential), infectadas por esporos produzidos nestes mesmos hospedeiros, na Austrália. As linhas diferenciadoras (ECD) utilizadas mostraram reações intermediárias de severidade em função das diferentes condições climáticas (luz, matéria orgânica, temperatura, pH) encontradas nesse país, que diferem das condições de cultivo européias. Isto indica a necessidade de uma reformulação das linhas diferenciadoras ECD, como já relatado por Dixon (2001) e Kuginuki et al. (1999). Recentemente, muitos estudos têm indicado o uso de métodos moleculares para a separação de patótipos de P. brassicae, na tentativa de oferecer melhores ferramentas para o desenvolvimento de cultivares de brássicas resistentes a HDC em maior escala.
Hatakayema et al. (2006) também não utilizaram as plantas diferenciadoras de Williams (1966) e ECD, por não mostrarem resultados claros quanto à patogenicidade para isolados japoneses. Mas esses autores conseguiram fazer um agrupamento conforme o comportamento patogênico, o que também poderia ser feito para os isolados 2 e 10 deste trabalho, pois apresentaram características patogênicas semelhantes nos dois ensaios, para os mesmos hospedeiros, podendo ser considerados pertencentes a um mesmo grupo, embora tenham sido coletados em locais e em espécies diferentes de hospedeiros dentro do Estado de São Paulo.
Uma sugestão para um próximo trabalho seria a repetição dos ensaios nas mesmas épocas, porém em anos seqüentes. Entretanto, Dixon & Robinson (1986) também observaram diferenças quanto a patogenicidade de isolados, em diferentes hospedeiros testados em quatro anos seguidos na Escócia, mesmo não ocorrendo nenhuma anormalidade climática entre esses anos. Tal resultado sugere que o mecanismo de formação de hérnias é mais influenciado pelo metabolismo hormonal do hospedeiro e, conseqüentemente, pelo desenvolvimento da planta e seu vigor.
Os padrões de fragmentos gerados pela amplificação de DNA de P. brassicae, com os "primers" OPA-02 (TGCCGAGCTG) e OPB-10 (CTGCTGGGAC), mostraram o alto grau de polimorfismo do DNA das populações de P. brassicae, o que era esperado, por não se tratar de isolados homogêneos . Mesmo com estes resultados, obteve-se 81,6% de similaridade entre as populações, onde observamos a formação de três grupos geneticamente similares, sendo eles: Grupo 1: isolados 1, 2, 5, 10; Grupo 2: 3 e 7 e Grupo 3: 4, 6, 8, 9 e 11. Esses isolados não apresentaram um padrão genético específico quanto ao local de origem das populações avaliadas, mostrando que, mesmo em locais distantes e com diferenças quanto à patogenicidade, tais populações são geneticamente semelhantes. Os resultados obtidos nas análises moleculares e de severidade da doença, para hospedeiros inoculados com diferentes isolados, sugerem que os isolados 2 e 10 são possivelmente originários de um mesmo patótipo, mas pertencem a grupos geneticamente diferentes.
Estes resultados mostram que populações (isolados) coletadas de um mesmo local, em períodos e hospedeiros diferentes, como os isolados 10 e 11, são geneticamente diferentes, provavelmente resultante dos cruzamentos entre os possíveis distintos patótipos existentes dentro de uma mesma área e população de P. brassicae (Jones et al., 1982b). E isso nos leva a crer que hospedeiros resistentes, a uma determinada população de uma região, pode ter sua resistência alterada em regiões de cultivo próximas, pois cada população é evidentemente variável quanto à patogenicidade, indicando a necessidade de estudos mais detalhados para que essa variabilidade patogênica seja contornada e cultivares de brássicas com maior grau de resistência sejam desenvolvidas.
A alta variabilidade e não correlação entre os resultados obtidos em casa de vegetação e os moleculares sugere a realização de estudos futuros quanto a adaptação de análises moleculares mais refinadas para a análise de isolados brasileiros, como por exemplo, os desenvolvidos por Kageyama et al. (2003) que utilizaram a região ITS do DNA de populações coletadas de solos japoneses, e primers específicos para estudos similares ao desenvolvido. Faggian et al. (1999) também utilizaram a região ITS do DNA ribossomal (DNAr) e a técnica de nested PCR, por se tratar de uma região mais preservada.
Manzanares-Dauleux et al. (2001) também conseguiram, através da análise do DNA de nove populações de Plasmodiophora brassicae e de trinta e sete isolados monospóricos, com o uso de primers específicos e PCR - RAPD, diferenciar oito patótipos franceses. Outro fator que deve ser levado em consideração é a pequena quantidade de DNA coletado das estruturas de resistência de P. brassicae, que acabam por mascarar os padrões de fragmento de polimorfismo. Cao et al. (2007), entretanto, relatam que o patógeno pode ser detectado em tecidos do hospedeiro após 3 dias da inoculação, por meio de PCR, mesmo não ocorrendo a formação de hérnias antes de 24 dias, mostrando a viabilidade desta técnica para detecções precoces, e sua utilização em análises rotineiras de laboratório.
Parsons et al. (2003) descrevem que a técnica de PCR é capaz de detectar estruturas de repouso de P. brassicae viáveis e não viáveis de solo, mas que, para os não viáveis, a detecção decai com o passar do tempo de vida destas estruturas, o que também deve ser levado em consideração, pois somente interessa a detecção de materiais viáveis, o que ainda não é possível. Esses trabalhos reforçam o potencial de uso desta técnica, bem como a necessidade de aprimoramento de trabalhos voltados para a caracterização de possíveis patótipos de P. brassicae no Brasil, utilizando PCR e espécies de brássicas cultivadas no País, juntamente com algumas linhas diferenciadoras de ECD, para que informações mais conclusivas sejam obtidas, visando o controle da doença.
CRUZ, Juliana C. Sodário et al . Caracterização patogênica e molecular de Plasmodiophora brassicae. Trop. plant pathol., Brasília, v. 33, n. 6, dez. 2008 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1982-56762008000600003&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S1982-56762008000600003.
Poucos estudos foram desenvolvidos no Brasil sobre a doença hérnia das crucíferas, causada por Plasmodiophora brassicae. Realizou-se testes de severidade da doença causada por diferentes populações do patógeno em espécies de brássicas (couve-flor, couve-chinesa suscetível, couve-chinesa resistente, brócolis e repolho). As populações de P. brassicae foram obtidas de raízes de brássicas infectadas originárias de algumas regiões produtoras no Brasil. Os testes de severidade foram realizados em casa de vegetação (25±2ºC) mediante inoculações, no colo de cada planta com 2 mL da suspensão de esporos do patógeno, na concentração de 107 esporos mL-1. As avaliações ocorreram 35 dias após a inoculação. Em laboratório foi realizada a extração de DNA dessas populações e análises de PCR-RAPD para a comparação das características genéticas. As populações obtidas nas regiões de Carandaí MG e Colombo PR mostraram-se mais agressivas, manifestando patogenicidade até mesmo em cultivar considerada resistente. Entretanto, não foi observado um padrão genético específico quanto ao local de origem das populações avaliadas, sugerindo que mesmo em locais distantes e com diferenças quanto à severidade, tais populações são geneticamente semelhantes.
Palavras chaves: hérnia das crucíferas, PCR, patógeno de solo, Brassicaceae.
INTRODUÇÃO
Plasmodiophora brassicae Woronin é o patógeno responsável pela doença popularmente conhecida como hérnia das crucíferas (HDC), uma das mais importantes nas regiões produtoras de brássicas no mundo. Esta doença, característica de regiões de temperaturas amenas, em torno de ± 20ºC, vem ganhando expressão em áreas agrícolas tradicionalmente cultivadas com brássicas no Brasil. Uma vez presente no solo, as estruturas de resistência do patógeno podem sobreviver por mais de 15 anos (Wallenhammar, 1996), o que dificulta seu controle.
Em decorrência da dificuldade de seu isolamento, por se tratar de um parasita obrigatório, pouco se sabe sobre seu desenvolvimento em condições brasileiras de cultivo, o que explica a existência de maior número de trabalhos que avaliam o comportamento de populações de P. brassicae, como os realizados por Ito et al. (1999b) e Murakami et al. (2000) no Japão, quando comparados aos que utilizam isolados monospórico, como o realizado por Manzanares-Dauleux et al. (2001) na França. Alguns trabalhos relatam a existência de populações heterogêneas do patógeno em uma mesma área, podendo algumas estruturas de resistência serem patogênicas e outras não, sendo esta uma das maiores dificuldades metodológicas com quem trabalha com P. brassicae (Diederichsen et al., 1996). A forma mais recomendada de controle da HDC é a utilização de cultivares com maior nível de resistência, pois é considerada a maneira mais eficiente e econômica. Mas para que essa resistência a doença seja mantida, é fundamental o entendimento da diversidade do patógeno e os fatores que interferem na sua agressividade em condições ambientais brasileiras.
Pouco se sabe sobre a agressividade das populações brasileiras de P. brassicae, mas alguns trabalhos realizados em outros países trazem algumas importantes informações, principalmente com relação à observação de diferenças significativas existentes entre populações heterogêneas, como as obtidas na Austrália (Crute et al., 1983), Japão (Kuginuki et al., 1999) e Escócia (Jones et al., 1982a), bem como de isolados monospóricos, realizados por Somé et al. (1996) na França e Klever et al. (2001) na Alemanha. Para complementar as informações obtidas a campo sobre P. brassicae, a utilização de métodos moleculares pode permitir tanto a detecção precoce do patógeno no hospedeiro ou no solo, bem como a diferenciação de patótipos. Além disso, pode possibilitar melhor compreensão da relação entre P. brassicae e diferentes hospedeiros, visando o desenvolvimento de estratégias apropriadas de controle.
Parsons et al. (2003) e Faggian et al. (2003) conseguiram extrair o DNA das estruturas de repouso de P. brassicae de isolados encontrados em solos australianos, e utilizaram esse DNA extraído para análises de PCR. Desta maneira, obtiveram uma metodologia de detecção do patógeno antes do cultivo do hospedeiro. Entretanto, os autores ressaltam que a técnica não é viável quando existem baixas concentrações das estruturas de repouso no solo. Ito et al. (1999a) também demonstraram a viabilidade do uso da técnica de PCR para o estudo genético do DNA de P. brassicae, extraído de estruturas de repouso do patógeno encontrados em solos, e de estruturas presentes nos tecidos de hospedeiros (Ito et al., 1999b). Este trabalho teve como objetivo a avaliação da patogenicidade e severidade de alguns isolados (populações) brasileiros de P. brassicae, coletados a campo, bem como a caracterização molecular desses isolados, na tentativa de se obter maiores informações que possam favorecer o controle da doença e o desenvolvimento de novas cultivares resistentes.
MATERIAL E MÉTODOS
Isolados de Plasmodiophora brassicae
Raízes de brássicas apresentando sintomas de hérnias, naturalmente infectadas por P. brassicae, foram coletadas de áreas agrícolas brasileiras e analisadas no laboratório de Fitopatologia da Faculdade de Ciências Agronômicas, Departamento de Produção Vegetal/Defesa Fitossanitária, UNESP, Botucatu, SP, onde foram congeladas em freezer comum antes de serem utilizadas (Cruz et al., 2009). Destes materiais, onze isolados (populações) foram selecionados e catalogados conforme local, data de coleta e hospedeiro.
Teste de Patogenicidade
Dois ensaios foram conduzidos nos períodos de junho a setembro (ensaio I) e agosto a outubro (ensaio II) de 2006. Para tanto, os onze isolados foram multiplicados em mudas de couve-chinesa (Brassica rapa var. pekinensis), de uma cultivar suscetível ao patógeno (Pak choi), para que suas estruturas de repouso fossem ativadas após os períodos de armazenamento em freezer. Mudas de couve-flor (B. oleraceae var. botrytis), cultivar Sharon; brócolis (B. oleracea L. var. italica) cultivar Ramoso Santana; repolho (B. oleracea var. capitata) cultivar Kenzan; couve-chinesa - cultivar suscetível (B. rapa var. pekinensis) Pak choi; couve-chinesa - cultivar resistente (B. rapa var. pekinensis) Komachi, com quatro semanas de semeadura foram transplantadas para vasos com capacidade de 1,7L, contendo solo estéril, inoculadas e irrigadas, quando necessário. Os ensaios foram mantidos em condições parcialmente controladas de casa de vegetação (±25ºC), nas dependências do Departamento de Produção Vegetal/Defesa Fitossanitária da FCA-UNESP, Botucatu (SP), conduzidos em diferentes períodos: I: 28/07/06 a 01/09/06; II: 25/09/06 a 30/10/06.
Para a inoculação, 10 gramas de raízes, mostrando sintomas típicos de hérnias foram trituradas em liquidificador, por um minuto, com 200 mL de água destilada. Entre as triturações dos diferentes isolados, o copo do liquidificador foi desmontado e desinfestado por lavagem em água corrente com detergente comum, depois em solução de álcool a 70%, por 1 minuto, solução de hipoclorito de sódio a 2% por 1 minuto, e finalmente, enxaguado em água corrente. As suspensões obtidas foram filtradas em camadas de gaze para a retirada de fragmentos de raízes e a concentração de inóculo ajustada com o auxílio de hemacitômetro. Em seguida foram feitas inoculações no colo de cada planta, com 2 mL da suspensão de esporos de P. brassicae, na concentração de 107 esporos mL-1.
Cada tratamento contou com seis repetições, onde cada repetição foi composta de um vaso com uma planta, distribuídas em blocos ao acaso. Passadas cinco semanas após a inoculação, as raízes foram lavadas e avaliadas. Para tanto foi utilizada uma escala visual de notas variando de 0 a 4 (0=0%, 1=25%, 2=50%, 3=75% e 4=100%), conforme a porcentagem da área radicular afetada (Takahashi et al., 2005). Os dados foram submetidos à análise de variância não paramétrica de Kruskal-Wallis, para o modelo com dois fatores em blocos completos, sendo os tratamentos distribuídos de forma casual, quanto ao hospedeiro e local de origem, complementada com o respectivo teste de comparações múltiplas (Zar, 1999), obtendo-se dessa maneira a mediana e semi-amplitude total da severidade da doença causada por P. brassicae, para cada isolado em diferentes hospedeiros de cada ensaio. Raízes dos hospedeiros que apresentaram sintomas de hérnias e nota igual ou acima de 1 (aproximadamente 25% da área radicular afetada) foram considerados suscetíveis aos isolados testados.
Extração de DNA
O DNA dos isolados de P. brassicae foi obtido mediante suspensões de esporos, onde 10g de raízes contendo sintomas de HDC de cada isolado foram trituradas em liquidificador, com 50 mL de água destilada esterilizada por 1 minuto, para que a suspensão ficasse concentrada. Posteriormente, essa suspensão foi filtrada em dez camadas de gaze e acondicionada em microtubos com capacidade de 1000µL, sendo então precipitada por centrifugação a 2.500g, durante 10 minutos, repetindo a operação quatro vezes.
O sobrenadante obtido foi descartado das amostras. Adicionou-se, em seguida, 700 µL da solução I (100mM MgCl2; 200mM Tris-HCl pH 7,4; 30 µg mL-1 DNAse) que foi incubada a 37ºC em "banho maria" por 3 horas, este passo é imprescindível para eliminação do DNA do hospedeiro, o qual poderia interferir nas análises. Em seguida, efetuou-se a centrifugação por 2.500g, durante cinco minutos e descartou-se o sobrenadante. Os precipitados foram então ressuspendidos em 700µL da solução II (5mM EDTA; 0,5% SDS; 10mM Tris-HCl pH 7,8; 20 µg mL-1 de proteinase K) e incubado a 37ºC, por 30 minutos, e novamente centrifugado por 2.500g durante cinco minutos sendo o sobrenadante novamente descartado (Manzanarez-Daulex et al., 2001).
O DNA foi extraído de acordo com o protocolo CTAB modificado (Doyle & Doyle, 1990) adicionando-se 300µL de tampão de extração (2% CTAB; 1,4M NaCl; 20mM EDTA; 100mM Tris-Cl pH 7,8; 0,2% mercaptoetanol) e incubado por 30 minutos, a 65ºC. O material obtido foi centrifugado a 1.100g por 1 minuto, e o sobrenadante, transferido para um novo tubo.
O mesmo volume (300µL) da mistura de clorofórmio e álcool isoamílico (CIA 24:1) foi adicionado e homogeneizado em vortex, em seguida, centrifugou-se a 1.100g por 2 minutos. A fase superior, aproximadamente 500 µL, foi transferida para novo tubo. O DNA foi precipitado com 2/3 do volume de isopropanol gelado e mantido no gelo por 30 minutos, então submetido à centrifugação por 15 minutos, a 1.100g.
O sobrenadante foi descartado e, ao precipitado, adicionado 1 mL de álcool 70% sendo centrifugado por 10 minutos a 1.100g. O sobrenadante foi novamente descartado, e o precipitado permaneceu secando a temperatura ambiente, por aproximadamente 15 minutos. Depois esse precipitado foi dissolvido em 20 µL de TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA) e 20 µg mL-1 de RNAse sendo, em seguida, deixado a 37ºC, por 12 horas.
PCR-RAPD
Para as reações de PCR-RAPD, segundo Manzanares-Dauleux et al. (2001) modificado, o DNA de cada material foi quantificado em espectofotômetro, determinando-se a razão A260/A280 de todas as amostras de DNA para verificar a pureza dos ácidos nucléicos. A solução estoque de DNA foi diluída em uma concentração final de 5ng/µL e estocada em freezer a -20ºC, para que o DNA não fosse degradado, sendo posteriormente descongelada para a realização das análises de RAPD.
Em testes preliminares foram selecionados 12 primers arbitrários, obtidos da Operon Technologies Inc. (Alameda, CA, USA), sendo eles: OPB-10 (CTGCTGGGAC), OPA-2 (TGCCGAGCTG), OPP-7 (GTCCATGCCA), OPP-10 (TCCCGCCTAC), OPA-3 (AGTCAGCCAC), OPG-13 (CTCTCCGCCA), OPA-7 (GAAACGGGTG), OPP-13 (GGAGTGCCTC), OPF-13 (GGCTGCAGAA), OPA-10 (GTGATCGCAG), OPA-13 (CAGCACCCAC) e OPC-16 (CACACTCCAG), que permitiram a melhor visualização do padrão de fragmentos gerados pela amplificação de DNA de P. brassicae.
Cada reação de PCR-RAPD foi composta de 7,5 µL de DNA genômico (1ng/µL) e 22,5 µL de solução mix de reação [(7,45 µL de água ultra pura esterilizada, 3,0 µL de solução tampão, 2,4 µL de dNTP, 9,2 µL de cada um dos "primers" descritos acima e 0,45 unidades de Taq polymerase (Invitrogen, Groningen, Holanda)], totalizando 30 µL em tubos de PCR com capacidade de 200 µL. O DNA foi substituído pelo mesmo volume de água ultra pura esterilizada para servir como controle.
A amplificação foi realizada em termociclador PTC-100 (MJ Research Inc., Waterown, MA), programado para iniciar o ciclo de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, seguido de 45 ciclos de 30 segundos a 92ºC, 1 minuto a 35ºC e 2 minutos e 30 segundos a 72ºC, com extensão final de 72ºC por 5 minutos. Os produtos de RAPD foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,5% e TBE 1X , a 4V/cm de gel, onde foram utilizados 10 µL do material da reação misturados com 5 µL de tampão de carregamento (0,25 % de azul de bromofenol e 40% de sacarose) (Sambrook et al., 1987) e 5 µL de marcador 1kb, também misturados com 5 µL de tampão de carregamento. Posteriormente, as bandas foram visualizadas e fotografadas sob luz ultravioleta em Eagle Eye II (Stratagene).
Os dados foram registrados na forma de ausência/presença das bandas no gel. Bandas de mesmo comprimento foram consideradas como idênticas. Estes dados foram codificados na forma binária (1 para presença e 0 para ausência). A distância genética entre os isolados de P. brassicae foi determinada pelo coeficiente de similaridade de Nei & Li (1979). A matriz de similaridade foi, em seguida, transformada em um dendrograma não enraizado, utilizando-se o método SAHN Clustering (Sequential Agglomerative, Hierarchical and Nested) sob procedimento UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averaging), no programa PAUP* (version 4.0b5a) (Swofford, 2002).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos onze isolados analisados, nove foram patogênicos à cultivar de couve-chinesa suscetível (Pak choi) no ensaio I, realizado no período de junho a setembro de 2006, e dois isolados não foram patogênicos, os isolados 3 (Piedade-SP) e 6 (Colombo 2-PR) . No ensaio II todos os isolados foram altamente agressivos para esta cultivar. Embora o isolado 3 não tenha sido patogênico no ensaio I, no ensaio II este isolado foi patogênico para couve-flor, couve-chinesa suscetível e repolho, e o isolado 6, somente para a cultivar de couve-chinesa suscetível neste mesmo ensaio, o que pode indicar certa preferência destes isolados para se desenvolverem em períodos que tendem a ser mais quentes do ano (setembro a outubro).
Os diferentes resultados podem ser atribuídos ao efeito do ambiente e adaptação dos isolados às condições climáticas de cultivo ocorridas no ensaio II (meses de setembro a outubro de 2006), provavelmente devido ao maior comprimento do dia e intensidade luminosa encontrada nessa época do ano, quando comparado ao ensaio I. Os fatores ambientais não controlados na casa de vegetação utilizada podem ter deixado os hospedeiros mais propensos às infecções para esses isolados. A severidade de P. brassicae é resultado da interação do genótipo do hospedeiro com o genótipo do patógeno e as condições de cultivo, onde plantas altamente suscetíveis que estão em condições de cultivo adversas, podem ser infectadas por um isolado que não é altamente agressivo e desenvolverem os sintomas, reforçando o conceito clássico de doenças.
Em contraste, um hospedeiro altamente resistente requer um isolado altamente agressivo e condições de campo ótimas para o desenvolvimento do patógeno para que ocorra o desenvolvimento da doença. Esta é a possível explicação para as diferentes reações patogênicas nas duas épocas de desenvolvimento do ensaio, visto que os hospedeiros apresentaram menor desenvolvimento da doença no ensaio II, onde o clima pode ter favorecido o desenvolvimento dos hospedeiros e prejudicado o dos isolados.
O efeito contrário foi observado no ensaio I, cultivado nos meses de julho a setembro, onde a maioria dos isolados de P. brassicae foi mais agressiva, pois o patógeno provavelmente foi favorecido pelo ambiente de cultivo, embora o solo utilizado neste ensaio tenha apresentado maiores índices médios de matéria orgânica e cálcio que o solo utilizado no ensaio II, o que poderia ter proporcionado sua supressividade (Niwa et al., 2007).
Os isolados 1 (Carandaí-MG), 8 (Colombo 4-PR) e 9 (Colombo 5-PR) mostraram-se patogênicos para a cultivar de couve-chinesa considerada resistente (Komachi) nos dois ensaios, mostrando que esses isolados foram capazes de quebrar a resistência inicial dessa cultivar independentemente do ambiente de cultivo. Os isolados 5 (Colombo 1-PR) e 7 (Colombo 3-PR) somente foram patogênicos em condições climáticas encontradas no ensaio I. Isto mostra que não seria prudente a indicação, da referida cultivar, para o plantio na região de Colombo-PR, independentemente da época de cultivo, e para a região de Carandaí-MG, no período de inverno brasileiro, pois pressupõe-se que nestas regiões de cultivo existam isolados altamente agressivos que podem causar o desenvolvimento da HDC nessa cultivar de couve-chinesa .
No ensaio I, mais isolados mostraram-se patogênicos para repolho, como por exemplo, 1, 2 5, 7, 8 e 9, diferindo dos dados obtidos no ensaio II, onde apenas os isolados 3 e 11 foram capazes de promover a formação de hérnias. O mesmo também foi observado para a cultivar utilizada de brócolis, no ensaio I, onde os isolados 1, 5, 8, 9 e 10 provocaram a formação de hérnias. Já no ensaio II, apenas o isolado 9 mostrou-se patogênico a brócolis, indicando ser altamente suscetível a esse isolado (Colombo 5-PR). Portanto esta cultivar de brócolis (Ramoso Santana) não deve ser recomendada para o cultivo na região de Colombo-PR. Os resultados mostram que de maneira geral, os isolados de Carandaí-MG e os da região de Colombo-PR apresentaram maior severidade, dentro dos ensaios desenvolvidos para os diferentes hospedeiros, quando comparados aos isolados coletados no Estado de São Paulo.
Para os demais hospedeiros, a patogenicidade dos isolados não foi uniforme, já que para couve-flor, no ensaio I foram patogênicos os isolados 1, 8 e 9, já no ensaio II, apenas o isolado 3 causou sintomas, que não havia se mostrado patogênico no ensaio anterior. Estas variações são compreensíveis, visto que cada população pode apresentar estruturas de repouso com diferentes graus de severidade, podendo desenvolver a doença conforme as condições ambientais presentes em determinados momentos (Williams, 1966).
Algumas repetições, dentro de cada parcela para determinados isolados com menor severidade, apresentaram plantas com formação de hérnias nos ensaios I e II, indicando que estes isolados podem apresentar potencial de desenvolvimento da doença, dependendo do ambiente de cultivo utilizado, como mostram os isolados: 10 para couve-flor; 4 para repolho e os 2 e 7 para brócolis no ensaio I e os isolados 1, 4, 6, 7, 9, 10 e 11 para couve-flor; 5 e 7 para couve-chinesa Komachi (resistente); 2, 4, 6, 7, 8 e 9 para repolho e os 3, 4, 6 e 7 para brócolis no ensaio II.
Muitos estudos desenvolvidos com P. brassicae utilizaram linhas de hospedeiros diferenciadores da European Clubroot Differential (ECD) como referenciais em trabalhos similares a este. Entretanto, Kuginuki et al. (1999) comparando os hospedeiros da ECD e os utilizados por Williams (1966) em cultivares japonesas, com relação a populações de P. brassicae, verificaram que esses hospedeiros diferenciais (ECD) não classificaram claramente 36 populações japonesas quanto à patogenicidade. Esses autores relatam que os resultados dependem da pureza genética das cultivares e que o ideal, para este tipo de estudo, ainda são os materiais oriundos de isolamentos monospóricos, que apresentam maior homogeneidade genética.
Este tipo de isolamento, entretanto, pode apresentar baixa porcentagem infectiva, provavelmente em decorrência da variabilidade genética dos isolados coletados a campo, como no trabalho desenvolvido por Somé et al. (1996), que obteve aproximadamente 10% das mudas inoculadas monosporicamente com sintomas. Jones et al. (1982b) também se depararam com a mesma problemática, pois apenas três plantas de B. campestris var. pekinensis cv Granaat (suscetível) apresentaram hérnias quando inoculadas monosporicamente, considerando-se as 450 inoculadas menos de 1% de sucesso foi obtido utilizando esta técnica.
Donald et al. (2006) também observaram a interferência das condições climáticas de cultivo no desenvolvimento de sintomas em linhas diferenciadoras da ECD (European Clubroot Differential), infectadas por esporos produzidos nestes mesmos hospedeiros, na Austrália. As linhas diferenciadoras (ECD) utilizadas mostraram reações intermediárias de severidade em função das diferentes condições climáticas (luz, matéria orgânica, temperatura, pH) encontradas nesse país, que diferem das condições de cultivo européias. Isto indica a necessidade de uma reformulação das linhas diferenciadoras ECD, como já relatado por Dixon (2001) e Kuginuki et al. (1999). Recentemente, muitos estudos têm indicado o uso de métodos moleculares para a separação de patótipos de P. brassicae, na tentativa de oferecer melhores ferramentas para o desenvolvimento de cultivares de brássicas resistentes a HDC em maior escala.
Hatakayema et al. (2006) também não utilizaram as plantas diferenciadoras de Williams (1966) e ECD, por não mostrarem resultados claros quanto à patogenicidade para isolados japoneses. Mas esses autores conseguiram fazer um agrupamento conforme o comportamento patogênico, o que também poderia ser feito para os isolados 2 e 10 deste trabalho, pois apresentaram características patogênicas semelhantes nos dois ensaios, para os mesmos hospedeiros, podendo ser considerados pertencentes a um mesmo grupo, embora tenham sido coletados em locais e em espécies diferentes de hospedeiros dentro do Estado de São Paulo.
Uma sugestão para um próximo trabalho seria a repetição dos ensaios nas mesmas épocas, porém em anos seqüentes. Entretanto, Dixon & Robinson (1986) também observaram diferenças quanto a patogenicidade de isolados, em diferentes hospedeiros testados em quatro anos seguidos na Escócia, mesmo não ocorrendo nenhuma anormalidade climática entre esses anos. Tal resultado sugere que o mecanismo de formação de hérnias é mais influenciado pelo metabolismo hormonal do hospedeiro e, conseqüentemente, pelo desenvolvimento da planta e seu vigor.
Os padrões de fragmentos gerados pela amplificação de DNA de P. brassicae, com os "primers" OPA-02 (TGCCGAGCTG) e OPB-10 (CTGCTGGGAC), mostraram o alto grau de polimorfismo do DNA das populações de P. brassicae, o que era esperado, por não se tratar de isolados homogêneos . Mesmo com estes resultados, obteve-se 81,6% de similaridade entre as populações, onde observamos a formação de três grupos geneticamente similares, sendo eles: Grupo 1: isolados 1, 2, 5, 10; Grupo 2: 3 e 7 e Grupo 3: 4, 6, 8, 9 e 11. Esses isolados não apresentaram um padrão genético específico quanto ao local de origem das populações avaliadas, mostrando que, mesmo em locais distantes e com diferenças quanto à patogenicidade, tais populações são geneticamente semelhantes. Os resultados obtidos nas análises moleculares e de severidade da doença, para hospedeiros inoculados com diferentes isolados, sugerem que os isolados 2 e 10 são possivelmente originários de um mesmo patótipo, mas pertencem a grupos geneticamente diferentes.
Estes resultados mostram que populações (isolados) coletadas de um mesmo local, em períodos e hospedeiros diferentes, como os isolados 10 e 11, são geneticamente diferentes, provavelmente resultante dos cruzamentos entre os possíveis distintos patótipos existentes dentro de uma mesma área e população de P. brassicae (Jones et al., 1982b). E isso nos leva a crer que hospedeiros resistentes, a uma determinada população de uma região, pode ter sua resistência alterada em regiões de cultivo próximas, pois cada população é evidentemente variável quanto à patogenicidade, indicando a necessidade de estudos mais detalhados para que essa variabilidade patogênica seja contornada e cultivares de brássicas com maior grau de resistência sejam desenvolvidas.
A alta variabilidade e não correlação entre os resultados obtidos em casa de vegetação e os moleculares sugere a realização de estudos futuros quanto a adaptação de análises moleculares mais refinadas para a análise de isolados brasileiros, como por exemplo, os desenvolvidos por Kageyama et al. (2003) que utilizaram a região ITS do DNA de populações coletadas de solos japoneses, e primers específicos para estudos similares ao desenvolvido. Faggian et al. (1999) também utilizaram a região ITS do DNA ribossomal (DNAr) e a técnica de nested PCR, por se tratar de uma região mais preservada.
Manzanares-Dauleux et al. (2001) também conseguiram, através da análise do DNA de nove populações de Plasmodiophora brassicae e de trinta e sete isolados monospóricos, com o uso de primers específicos e PCR - RAPD, diferenciar oito patótipos franceses. Outro fator que deve ser levado em consideração é a pequena quantidade de DNA coletado das estruturas de resistência de P. brassicae, que acabam por mascarar os padrões de fragmento de polimorfismo. Cao et al. (2007), entretanto, relatam que o patógeno pode ser detectado em tecidos do hospedeiro após 3 dias da inoculação, por meio de PCR, mesmo não ocorrendo a formação de hérnias antes de 24 dias, mostrando a viabilidade desta técnica para detecções precoces, e sua utilização em análises rotineiras de laboratório.
Parsons et al. (2003) descrevem que a técnica de PCR é capaz de detectar estruturas de repouso de P. brassicae viáveis e não viáveis de solo, mas que, para os não viáveis, a detecção decai com o passar do tempo de vida destas estruturas, o que também deve ser levado em consideração, pois somente interessa a detecção de materiais viáveis, o que ainda não é possível. Esses trabalhos reforçam o potencial de uso desta técnica, bem como a necessidade de aprimoramento de trabalhos voltados para a caracterização de possíveis patótipos de P. brassicae no Brasil, utilizando PCR e espécies de brássicas cultivadas no País, juntamente com algumas linhas diferenciadoras de ECD, para que informações mais conclusivas sejam obtidas, visando o controle da doença.
CRUZ, Juliana C. Sodário et al . Caracterização patogênica e molecular de Plasmodiophora brassicae. Trop. plant pathol., Brasília, v. 33, n. 6, dez. 2008 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1982-56762008000600003&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S1982-56762008000600003.
Determinação pré-natal do sexo fetal por meio da análise de DNA no plasma materno
OBJETIVO: avaliar um novo método de determinação do sexo fetal pela análise de DNA obtido do plasma materno.
MÉTODOS: sangue periférico (10 mL) foi coletado de mulheres grávidas em diferentes idades gestacionais. O plasma foi separado e o DNA isolado do mesmo foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores derivados do gene DYS14 específico do cromossomo Y.
RESULTADOS: foram analisadas amostras de 212 pacientes. O resultado da PCR foi comparado ao sexo determinado pela ultra-sonografia e/ou do nascimento. Houve concordância em 209 das 212 pacientes. Nos 3 casos discordantes a PCR apontou resultado feminino, sendo as três amostras coletadas antes da 8ª semana de gravidez.
CONCLUSÃO: o método de PCR desenvolvido para a determinação do sexo fetal possui excelente sensibilidade e especificidade, permitindo seu uso rotineiro. O resultado de sexo masculino possui maior confiabilidade que o feminino, principalmente em idade gestacional precoce. Novas aplicações para o DNA fetal no plasma materno estão sendo pesquisadas, permitindo no futuro o diagnóstico não invasivo de uma série de doenças.
Palavras-chave : PCR - Reação em cadeia da polimerase; DNA plasmático; Sexo fetal.
Introdução
O desenvolvimento e aprimoramento de técnicas não invasivas de diagnóstico são objetivos constantemente almejados na medicina. As técnicas de diagnóstico por imagem representam uma face muito importante deste processo, e os métodos laboratoriais baseados em amostras biológicas uma segunda vertente.
O diagnóstico pré-natal de uma série de intercorrências requer o uso de métodos invasivos, como a realização de biópsia de vilosidade coriônica ou a obtenção de líquido amniótico, com risco significativo de perda do feto. Nesse contexto, técnicas não invasivas de amostragem de células fetais têm sido intensamente pesquisadas há muitas décadas1.
Em 1989, Lo et al.2 demonstraram ser factível a análise destas células fetais presentes na circulação materna por método de biologia molecular, a reação em cadeia de polimerase (PCR). O isolamento de células fetais da circulação materna é tecnicamente bastante complexo, sendo ainda hoje pouco realizado3, aumentando o interesse por técnicas que prescindam do isolamento das células fetais.
Alguns anos mais tarde, pesquisadores na área de oncologia demonstraram a existência de DNA tumoral livre (cell-free) no plasma de pacientes4. Estes achados tiveram grande repercussão e estimularam inúmeras pesquisas que comprovaram a presença do DNA tumoral em diferentes tipos de neoplasia, sendo atualmente empregadas no diagnóstico precoce de recidiva e na avaliação do prognóstico5.
Baseados nestes dados, em 1997 Lo et al.6. demonstraram fenômeno análogo, a presença de DNA fetal no plasma de mulheres grávidas. Diversos grupos reproduziram estes achados, demonstrando claramente a superioridade prática do DNA fetal plasmático em relação às preparações de células fetais isoladas do sangue materno. Além disso, o isolamento do DNA fetal a partir do plasma materno é relativamente fácil, barato e permite o processamento simultâneo de muitas amostras. De fato, a análise quantitativa do DNA fetal presente no plasma demonstrou que este pode compor até 3-4% do DNA total, ao passo que as células fetais podem estar presentes no sangue materno numa proporção igual ou inferior a 1:100.000 células maternas7.
A maior parte dos grupos utilizou como marcador de DNA fetal, por motivos práticos, seqüências do cromossomo Y em grávidas de fetos masculinos. Uma vez comprovada a reprodutibilidade e sensibilidade do método, outros alvos estão sendo investigados, entre estes destaca-se a determinação do genótipo Rh(D)8, a b-talassemia9, a acondroplasia10 e até a síndrome de Down11.
Os trabalhos mais recentes já utilizam técnicas mais modernas de PCR, baseadas em equipamentos de detecção em tempo real (real-time PCR), atingindo níveis mais altos de sensibilidade e menor risco de contaminação, devido ao fato de o formato fechado da reação evitar manipulações analíticas do amplicon12.
Neste trabalho procuramos desenvolver e adaptar uma técnica de PCR convencional para determinação do sexo fetal pela análise do plasma materno, e buscamos avaliar a sensibilidade e especificidade deste método em uma casuística de 212 mulheres grávidas em diferentes idades gestacionais.
Pacientes e Métodos
Este foi um estudo prospectivo não randomizado. As pacientes interessadas em participar do estudo foram encaminhadas ao Banco de Sangue do Hospital Sírio Libanês de São Paulo, SP, onde lhes era apresentado o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), contendo uma série de informações sobre o teste. Havendo concordância, a paciente assinava o TCLE e, logo após, uma amostra de 10 mL de sangue periférico era coletada. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Sírio Libanês (CEPesq, protocolo 2003/05).
O sangue foi coletado em tubos PPT (Plasma Preparation Tube, Beckton-Dickinson, São Paulo, Brasil) e centrifugado por 10 minutos a 1.100 g (temperatura ambiente). Estes tubos são próprios para análises por métodos moleculares já que contém EDTA como anticoagulante na forma sólida, não havendo, portanto, diluição da amostra, o que pode acarretar erros de estimativa de carga viral, por exemplo, já que os tubos convencionais usam anticoagulantes líquidos que podem levar a uma diluição de até 15% da amostra. Após a centrifugação os tubos eram armazenados a 4oC e encaminhados ao laboratório em até 48 horas. No laboratório fez-se o isolamento do DNA em duplicatas de 140 mL de plasma, empregando-se o QIAamp Blood Mini Kit da Qiagen (Chattlesworth, CA, EUA). Neste método o plasma é submetido a uma lise enzimática com proteinase K, subseqüentemente é tratado com um agente caotrópico, o hidrocloreto de guanidina, e este lisado é finalmente passado através de uma coluna de sílica, que possue afinidade por ácidos nucléicos. Após sucessivas lavagens o DNA/RNA aderido à sílica é eluído com tampão adequado, provido no kit. Fizemos a eluição com 75 mL de tampão, portanto cada microlitro de eluato corresponde a aproximadamente 2 mL de plasma.
As alíquotas de DNA isolado foram submetidas à reação de PCR empregando-se os primers Y7/Y8 que amplificam um fragmento de 198 pares de bases da seqüência cópia-única e específica do cromossomo Y DYS1413. Cada extrato foi amplificado também em duplicata. Portanto, cada amostra corresponde a quatro reações de PCR. Como controle, todos os extratos foram também submetidos à amplificação de um fragmento de 268 pares de bases do gene da b-globina humana14. Os produtos de PCR foram observados por meio de eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio e as imagens foram digitalizadas e armazenadas em computador. O padrão de peso molecular 100 bp ladder (Invitrogen, São Paulo, Brasil) foi utilizado para averiguar-se o tamanho do produto amplificado. A presença de 3 ou 4 bandas correspondendo ao fragmento de 198 pares de bases do cromossomo Y foi interpretada como indicativo de feto do sexo masculino.
Resultados
Entre as 212 amostras coletadas houve 97 resultados de sexo masculino e 115 de sexo feminino. Apenas três amostras apresentaram resultado errado, todas coletadas de grávidas com menos de 8 semanas de idade gestacional. Nestes 3 casos, o PCR apontou ausência de amplificação (= sexo feminino) e, posteriormente, verificou-se tratar de gravidez de feto masculino. Todos os outros 209 resultados foram corretos, levando a índice de acerto de 100% em idade gestacional de mais de 8 semanas. Amostras que apresentaram 1 ou 2 reações positivas, das 4 executadas, foram submetidas à repetição do processo, o que ocorreu em 10% das amostras.
Discussão
O método de PCR trouxe nestes últimos 20 anos grandes contribuições às ciências biológicas, incluindo a medicina. Trata-se de técnica relativamente simples, rápida, barata e de grande sensibilidade. Este trabalho vale-se principalmente desta última característica, que deriva da amplificação exponencial de um fragmento de DNA, ao longo dos ciclos da reação. A definição do fragmento a ser amplificado tornou-se mais simples com os avanços das técnicas de seqüenciamento e os dados provindos dos diferentes projetos Genoma, disponibilizando o acesso às seqüências de DNA, empregadas na produção do reagente específico da PCR que são os primers.
A enorme sensibilidade da PCR permite detectar pequenas quantidades de DNA fetal presente no plasma materno. Este DNA provém de diferentes tipos de células fetais, mas no plasma materno ocorre enriquecimento deste DNA fetal, cuja quantidade aumenta conforme a evolução da gravidez7. No entanto, não é possível separar-se o DNA fetal do DNA materno igualmente presente no plasma, mas em maiores quantidades. Portanto, o diagnóstico do genótipo fetal só é possível quando este for diferente do materno. No caso específico da sexagem fetal, não há necessidade de conhecimento do genótipo materno, a priori, já que obviamente mãe e filho diferem quanto à presença do cromossomo Y. Outra situação evidente é o caso de mães Rh negativas, pois sabe-se que este fenótipo é causado por deleção quase completa do gene RhD. Havendo a detecção deste gene infere-se que o feto é Rh positivo15. Outras situações específicas irão provavelmente requerer a análise dos genótipos materno e paterno, para a execução e avaliação do teste16.
A determinação do sexo fetal vem sendo descrita por laboratórios de diferentes países, com resultados muito precisos17,18. Pesquisadores franceses trabalharam com 121 amostras de mulheres no primeiro trimestre da gravidez (média = 11,8 semanas), obtendo 100% de concordância17, enquanto no Japão, o grupo de Sezikawa et al.18 analisou 302 amostras de mulheres com gravidez entre a 7ª e a 16ª semana, havendo erro em apenas 4 resultados, todos falso-negativos, ou seja, não se detectou a presença de DNA do cromossomo Y, mas o feto era masculino. Nestes casos as pacientes estavam com 9 (2 pacientes), 11 e 13 semanas de gestação, respectivamente.
Todos trabalhos ressaltam que se trata de técnica sujeita a variações, parte desta derivando dos métodos de coleta e preparo do DNA19, da escolha dos primers de PCR e da metodologia de PCR propriamente. A técnica aqui descrita teve que ser aprimorada ao longo de quatro anos até atingir o atual formato e índice de acerto descrito, permitindo seu uso rotineiro.
Com a utilização de metodologias ainda mais rápidas e sensíveis de PCR, como o PCR em tempo real, devem-se obter índices de acerto ainda maiores, inclusive em fases precoces da gravidez, ou seja, antes da 8ª semana. Além disso, os resultados das pesquisas em curso no momento permitirão sem dúvida, no futuro próximo, o uso clínico destes testes, reduzindo a necessidade de técnicas invasivas de amostragem20.
LEVI, José Eduardo; WENDEL, Silvano; TAKAOKA, Deise Tihe. Determinação pré-natal do sexo fetal por meio da análise de DNA no plasma materno. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., Rio de Janeiro, v. 25, n. 9, 2003 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-72032003000900011&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-72032003000900011.
MÉTODOS: sangue periférico (10 mL) foi coletado de mulheres grávidas em diferentes idades gestacionais. O plasma foi separado e o DNA isolado do mesmo foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores derivados do gene DYS14 específico do cromossomo Y.
RESULTADOS: foram analisadas amostras de 212 pacientes. O resultado da PCR foi comparado ao sexo determinado pela ultra-sonografia e/ou do nascimento. Houve concordância em 209 das 212 pacientes. Nos 3 casos discordantes a PCR apontou resultado feminino, sendo as três amostras coletadas antes da 8ª semana de gravidez.
CONCLUSÃO: o método de PCR desenvolvido para a determinação do sexo fetal possui excelente sensibilidade e especificidade, permitindo seu uso rotineiro. O resultado de sexo masculino possui maior confiabilidade que o feminino, principalmente em idade gestacional precoce. Novas aplicações para o DNA fetal no plasma materno estão sendo pesquisadas, permitindo no futuro o diagnóstico não invasivo de uma série de doenças.
Palavras-chave : PCR - Reação em cadeia da polimerase; DNA plasmático; Sexo fetal.
Introdução
O desenvolvimento e aprimoramento de técnicas não invasivas de diagnóstico são objetivos constantemente almejados na medicina. As técnicas de diagnóstico por imagem representam uma face muito importante deste processo, e os métodos laboratoriais baseados em amostras biológicas uma segunda vertente.
O diagnóstico pré-natal de uma série de intercorrências requer o uso de métodos invasivos, como a realização de biópsia de vilosidade coriônica ou a obtenção de líquido amniótico, com risco significativo de perda do feto. Nesse contexto, técnicas não invasivas de amostragem de células fetais têm sido intensamente pesquisadas há muitas décadas1.
Em 1989, Lo et al.2 demonstraram ser factível a análise destas células fetais presentes na circulação materna por método de biologia molecular, a reação em cadeia de polimerase (PCR). O isolamento de células fetais da circulação materna é tecnicamente bastante complexo, sendo ainda hoje pouco realizado3, aumentando o interesse por técnicas que prescindam do isolamento das células fetais.
Alguns anos mais tarde, pesquisadores na área de oncologia demonstraram a existência de DNA tumoral livre (cell-free) no plasma de pacientes4. Estes achados tiveram grande repercussão e estimularam inúmeras pesquisas que comprovaram a presença do DNA tumoral em diferentes tipos de neoplasia, sendo atualmente empregadas no diagnóstico precoce de recidiva e na avaliação do prognóstico5.
Baseados nestes dados, em 1997 Lo et al.6. demonstraram fenômeno análogo, a presença de DNA fetal no plasma de mulheres grávidas. Diversos grupos reproduziram estes achados, demonstrando claramente a superioridade prática do DNA fetal plasmático em relação às preparações de células fetais isoladas do sangue materno. Além disso, o isolamento do DNA fetal a partir do plasma materno é relativamente fácil, barato e permite o processamento simultâneo de muitas amostras. De fato, a análise quantitativa do DNA fetal presente no plasma demonstrou que este pode compor até 3-4% do DNA total, ao passo que as células fetais podem estar presentes no sangue materno numa proporção igual ou inferior a 1:100.000 células maternas7.
A maior parte dos grupos utilizou como marcador de DNA fetal, por motivos práticos, seqüências do cromossomo Y em grávidas de fetos masculinos. Uma vez comprovada a reprodutibilidade e sensibilidade do método, outros alvos estão sendo investigados, entre estes destaca-se a determinação do genótipo Rh(D)8, a b-talassemia9, a acondroplasia10 e até a síndrome de Down11.
Os trabalhos mais recentes já utilizam técnicas mais modernas de PCR, baseadas em equipamentos de detecção em tempo real (real-time PCR), atingindo níveis mais altos de sensibilidade e menor risco de contaminação, devido ao fato de o formato fechado da reação evitar manipulações analíticas do amplicon12.
Neste trabalho procuramos desenvolver e adaptar uma técnica de PCR convencional para determinação do sexo fetal pela análise do plasma materno, e buscamos avaliar a sensibilidade e especificidade deste método em uma casuística de 212 mulheres grávidas em diferentes idades gestacionais.
Pacientes e Métodos
Este foi um estudo prospectivo não randomizado. As pacientes interessadas em participar do estudo foram encaminhadas ao Banco de Sangue do Hospital Sírio Libanês de São Paulo, SP, onde lhes era apresentado o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), contendo uma série de informações sobre o teste. Havendo concordância, a paciente assinava o TCLE e, logo após, uma amostra de 10 mL de sangue periférico era coletada. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Sírio Libanês (CEPesq, protocolo 2003/05).
O sangue foi coletado em tubos PPT (Plasma Preparation Tube, Beckton-Dickinson, São Paulo, Brasil) e centrifugado por 10 minutos a 1.100 g (temperatura ambiente). Estes tubos são próprios para análises por métodos moleculares já que contém EDTA como anticoagulante na forma sólida, não havendo, portanto, diluição da amostra, o que pode acarretar erros de estimativa de carga viral, por exemplo, já que os tubos convencionais usam anticoagulantes líquidos que podem levar a uma diluição de até 15% da amostra. Após a centrifugação os tubos eram armazenados a 4oC e encaminhados ao laboratório em até 48 horas. No laboratório fez-se o isolamento do DNA em duplicatas de 140 mL de plasma, empregando-se o QIAamp Blood Mini Kit da Qiagen (Chattlesworth, CA, EUA). Neste método o plasma é submetido a uma lise enzimática com proteinase K, subseqüentemente é tratado com um agente caotrópico, o hidrocloreto de guanidina, e este lisado é finalmente passado através de uma coluna de sílica, que possue afinidade por ácidos nucléicos. Após sucessivas lavagens o DNA/RNA aderido à sílica é eluído com tampão adequado, provido no kit. Fizemos a eluição com 75 mL de tampão, portanto cada microlitro de eluato corresponde a aproximadamente 2 mL de plasma.
As alíquotas de DNA isolado foram submetidas à reação de PCR empregando-se os primers Y7/Y8 que amplificam um fragmento de 198 pares de bases da seqüência cópia-única e específica do cromossomo Y DYS1413. Cada extrato foi amplificado também em duplicata. Portanto, cada amostra corresponde a quatro reações de PCR. Como controle, todos os extratos foram também submetidos à amplificação de um fragmento de 268 pares de bases do gene da b-globina humana14. Os produtos de PCR foram observados por meio de eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio e as imagens foram digitalizadas e armazenadas em computador. O padrão de peso molecular 100 bp ladder (Invitrogen, São Paulo, Brasil) foi utilizado para averiguar-se o tamanho do produto amplificado. A presença de 3 ou 4 bandas correspondendo ao fragmento de 198 pares de bases do cromossomo Y foi interpretada como indicativo de feto do sexo masculino.
Resultados
Entre as 212 amostras coletadas houve 97 resultados de sexo masculino e 115 de sexo feminino. Apenas três amostras apresentaram resultado errado, todas coletadas de grávidas com menos de 8 semanas de idade gestacional. Nestes 3 casos, o PCR apontou ausência de amplificação (= sexo feminino) e, posteriormente, verificou-se tratar de gravidez de feto masculino. Todos os outros 209 resultados foram corretos, levando a índice de acerto de 100% em idade gestacional de mais de 8 semanas. Amostras que apresentaram 1 ou 2 reações positivas, das 4 executadas, foram submetidas à repetição do processo, o que ocorreu em 10% das amostras.
Discussão
O método de PCR trouxe nestes últimos 20 anos grandes contribuições às ciências biológicas, incluindo a medicina. Trata-se de técnica relativamente simples, rápida, barata e de grande sensibilidade. Este trabalho vale-se principalmente desta última característica, que deriva da amplificação exponencial de um fragmento de DNA, ao longo dos ciclos da reação. A definição do fragmento a ser amplificado tornou-se mais simples com os avanços das técnicas de seqüenciamento e os dados provindos dos diferentes projetos Genoma, disponibilizando o acesso às seqüências de DNA, empregadas na produção do reagente específico da PCR que são os primers.
A enorme sensibilidade da PCR permite detectar pequenas quantidades de DNA fetal presente no plasma materno. Este DNA provém de diferentes tipos de células fetais, mas no plasma materno ocorre enriquecimento deste DNA fetal, cuja quantidade aumenta conforme a evolução da gravidez7. No entanto, não é possível separar-se o DNA fetal do DNA materno igualmente presente no plasma, mas em maiores quantidades. Portanto, o diagnóstico do genótipo fetal só é possível quando este for diferente do materno. No caso específico da sexagem fetal, não há necessidade de conhecimento do genótipo materno, a priori, já que obviamente mãe e filho diferem quanto à presença do cromossomo Y. Outra situação evidente é o caso de mães Rh negativas, pois sabe-se que este fenótipo é causado por deleção quase completa do gene RhD. Havendo a detecção deste gene infere-se que o feto é Rh positivo15. Outras situações específicas irão provavelmente requerer a análise dos genótipos materno e paterno, para a execução e avaliação do teste16.
A determinação do sexo fetal vem sendo descrita por laboratórios de diferentes países, com resultados muito precisos17,18. Pesquisadores franceses trabalharam com 121 amostras de mulheres no primeiro trimestre da gravidez (média = 11,8 semanas), obtendo 100% de concordância17, enquanto no Japão, o grupo de Sezikawa et al.18 analisou 302 amostras de mulheres com gravidez entre a 7ª e a 16ª semana, havendo erro em apenas 4 resultados, todos falso-negativos, ou seja, não se detectou a presença de DNA do cromossomo Y, mas o feto era masculino. Nestes casos as pacientes estavam com 9 (2 pacientes), 11 e 13 semanas de gestação, respectivamente.
Todos trabalhos ressaltam que se trata de técnica sujeita a variações, parte desta derivando dos métodos de coleta e preparo do DNA19, da escolha dos primers de PCR e da metodologia de PCR propriamente. A técnica aqui descrita teve que ser aprimorada ao longo de quatro anos até atingir o atual formato e índice de acerto descrito, permitindo seu uso rotineiro.
Com a utilização de metodologias ainda mais rápidas e sensíveis de PCR, como o PCR em tempo real, devem-se obter índices de acerto ainda maiores, inclusive em fases precoces da gravidez, ou seja, antes da 8ª semana. Além disso, os resultados das pesquisas em curso no momento permitirão sem dúvida, no futuro próximo, o uso clínico destes testes, reduzindo a necessidade de técnicas invasivas de amostragem20.
LEVI, José Eduardo; WENDEL, Silvano; TAKAOKA, Deise Tihe. Determinação pré-natal do sexo fetal por meio da análise de DNA no plasma materno. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., Rio de Janeiro, v. 25, n. 9, 2003 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-72032003000900011&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 28 nov. 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-72032003000900011.
terça-feira, 27 de novembro de 2012
CONCLUSÃO
Podemos identificar através
desse estudo, embora a PCR possuir algumas limitações, a facilidade e o quão
rápido podem possuir o resultado que desejamos, e quantos assuntos na área da
pesquisa a PCR está envolvida de forma a contribuir com a
praticidade dos diagnósticos clínicos e as respostas para as indagações mais
frequentes.
Em alguns casos de possíveis contaminações de
DNA podendo comprometer os resultados, se faz necessário estabelecer um
controle e vigilância para que não ocorra danificação das amostras.
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