RESUMO
Desenvolveu-se
um método rápido para extração de DNA de bactérias, que ao contrário
de outros métodos, não requer o uso de enzimas, como lisozima e
proteinase K, previamente, utilizado-se o carbonato de silício
(carborundum) como agente físico para efetuar a quebrar da parede
celular da bactéria. Com este método conseguiu-se extrair DNA
bacteriano num menor tempo, além de mais rápido, ele mostrou-se mais
simples e econômico, quando comparado aos métodos convencionais. O DNA
obtido pode ser utilizado para diversas finalidades relacionadas ao DNA
de bactérias, obtendo-se uma quantidade razoável de DNA, que varia de
725 µg/mL a 1170 µg/mL por cada 0,1 g de célula bacteriana, com ótima
qualidade.
Palavras-chave adicionais: PCR, gram-positiva, gram-negativa
A parede
celular das células procarióticas sempre foi uma grande vantagem para
esses organismos, pois ela apresenta diversas características como
elasticidade, resistência a pressão, a altas temperaturas e a valores
extremos de pH. Tais características apresentam-se como um grande
desafio para a biologia molecular (1). A coloração diferencial de Gram
divide as bactérias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas,
sendo o grupo das Gram negativas em maior número para a fitopatologia. A
reação das bactérias à técnica de Gram é relacionada diretamente à
composição química, estrutural e a permeabilidade da parede celular
(3). A parede celular das bactérias Gram-positivas é constituída de uma
camada espessa composta por peptídioglicano, responsável pela sua
rigidez, já nas gram-negativas, a camada de peptidioglicano é mais
fina, relativamente, que consequentemente confere uma maior fragilidade
(3).
Essa
característica faz com que a quebra da parede celular nas
gram-positivas apresente maior dificuldade, que acaba por acarretar que
as técnicas utilizadas para a quebra desta parede sejam muitas vezes
trabalhosas, como a ruptura celular por sonicação, auxílio de enzimas
(lisozima e proteinases) tornado as técnicas mais custosa e demoradas
(2).
Atualmente
existe a grande necessidade de se obter técnicas baratas, rápidas e
eficientes para obtenção de DNA, visto que técnicas de identificação e
detecção de patógenos por PCR vêm se popularizando cada vez mais. Este
trabalho teve por objetivo avaliar um método de extração de DNA pela
quebra da parede celular, utilizando-se da ação mecânica, causada por
carbonato de silício (Carborundum), produto que apresenta granulométria
entorno de 320 mm e é quimicamente inerte. Carborundum ou carbonato de
silício é um produto abrasivo muito utilizado na fitopatologia para
efetuar pequenos ferimentos, os quais viabilizam a infecção por vírus
artificialmente.
Culturas bacterianas foram desenvolvidas em tubos do tipo Falconâ,
contendo 10 mL de meio de cultura Nutriente Líquido (1g extrato de
carne, 2g extrato de levedura, 5g peptona, 5g NaCl, 5g dextrose, 1000
ml água destilada esterilizada) por 24 horas, a 28ºC, sobre agitação
constante a 110 rpm. Após este período, as culturas foram centrifugadas
a 5000 g por 30 minutos, descartando-se o sobrenadante e obtendo-se um
precipitado, o qual foi ressuspendido em 1 mL de tampão de extração
(20 mM Tris pH 7.5, 25 mM EDTA, 75 mM NaCl e 1/10 volume de SDS 10% )
(4). O volume obtido foi transferido para um microtubo de 1,7 mL, no
qual foi acrescido de 0,2 gramas de carbonato de silício. Uma massa de
10 gramas de carbonato de silício foi previamente tratada com uma
solução de 50 mL de ácido clorídrico 10M, por 2 horas a temperatura de
30ºC, seguida de lavagem continua por 12 horas com água destilada, e
posteriormente foi autoclavado a 120ºC por 20 minutos e seco em estufa a
70ºC por 24 horas. O microtubo contendo tampão de extração mais
células bacterianas e o carbonato de silício foi agitado em aparelho
tipo "vortex" a 2000 rpm por 2 minutos, para romper a parede celular.
Os
tubos foram incubação por 30 minutos, a 50ºC, após este período,
acrescentou-se 2/3 do volume de NaCl 5 M e, deixou-se, por 30 minutos, a
4ºC. Centrifugou-os por 10 minutos, a 10.000 g, transferiu-se o
sobrenadante para novos microtubos de 1,7 mL e adicionou-se 1 volume de
clorofórmio, misturou-se vagarosamente e centrifulgou-se, por 10
minutos, a 10.000g. Transferiu-se a parte aquosa obtida para um novo
microtubo de 1,7 mL e adicionou-se um volume de isopropanol e incubou-o
em temperatura ambiente, por 5 minutos, procedendo em seguida um
centrifugação durante 10 minutos, a 10.000g, sendo descartado o
sobrenadante e o precipitado obtido (DNA) foi seco à temperatura
ambiente, durante 5 minutos, e então adicionou-se 40 µL de TE pH:8,0 +
RNAse 10µg/µL ao tubo e esse foi incubado por 60 minutos a 37ºC.
Após
a extração, cada amostra de DNA teve sua concentração e pureza
determinadas através das leituras de absorbância em 260 nm
(Concentração do DNA em µmg/ml = Absx100x50) (4) e em 280 nm
(quantificação de proteínas), no espectrofotômetro Ultrospec 3100 pro
(Amershan Pharmacia Biotech). A razão entre as leituras em 260 nm e 280
nm foi utilizada como um indicativo da pureza do DNA obtido. A
eletroforese para verificação da qualidade do DNA extraído foi
realizada em gel de agarose 0,8%. A esse gel foi aplicada uma amostra de
cada um dos microtubos (3 µl de água Milli-Q, 1 µl de corante azul de
bromofenol e 2 µl da solução de DNA). Utilizou-se como padrão de
comparação marcador Lambda (λ),
nas concentrações de 100 e 200 ng/mL. Após 50 minutos em eletroforese
a 90 voltz, o gel foi tratado com SYBR Safe™ DNA Gel Stain (Invitrogen
Corporation), conforme instrução do fabricante, e visualizado em um
aparelho transluminador com luz UV.
Procedeu-se
também uma reação de polimerase em cadeia (PCR) do gene ribossomal
16S dos DNAs extraídos, o qual foi amplificado utilizando-se
oligonucleotídeos universais (968 forward: AAC GCG AAG AAC CTT AC; 1401 reverse:
CGG TGT GTA CAA GAC CC) (4). A PCR foi realizada utilizando 1,0 ìl de
DNA, 10,0 pmol de cada oligonucleotídeo, 10 mM de dNTPs, 25 mM de MgCl2, 2,5 µl de PCR Buffer 10x e 1U de Taq DNA Polimerase (Fermentas Life Science)
para um volume final de 25 µl. A PCR foi realizada sob as seguintes
condições: aquecimento inicial a 95ºC, por 5 minutos, seguido de 30
ciclos de desnaturação a 95ºC, por 30 segundos, anelamento do
oligonucleotídeo a 57ºC, por 30 segundos, e alongamento a 72ºC, por 1
minuto. Um alongamento final de 5 minutos foi realizado após os ciclos.
Os produtos amplificados, de aproximadamente 430pb, foram examinados
por eletroforese em gel de agarose a 1%, com 5 Volts/cm, por 40
minutos. O gel foi corado com SYBR Safe™ DNA Gel Stain (Invitrogen
Corporation) e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Para
verificar a degradação dos DNA extraído efetuou-se uma análise
utilizando-se de gel de agarose 1% em eletroforese de campo pulsado, com
6 Volts/cm, ciclos de 25 por 35, por 12 horas de corrida e visualizado
em um aparelho transluminador com luz UV.
Na
análise do DNA por espectrofotometria mostrou uma boa qualidade deste.
Baseado nos valores da razão da absorbância de 260nm/280nm mostrou
que o DNA obtido estava de boa qualidade e com baixas concentrações de
proteínas e de RNA .
A análise da extração do DNA em gel de agarose mostrou que a
quantidade de quebra de DNA foi pequena, obtendo-se uma banda bem
visível com pouco sinal de degradação e com boa quantidade extraída quando efetuada a análise quantitativa do DNA em relação ao marcadorλ.
A quantificação por espectrofotometria mostrou que as concentrações dos DNAs extraídos variaram de 785 µg/mL a 1170 µg/ml. Na estimativa de rendimento da extração, relativa a uma massa de célula bacteriana de 0,1 grama, de células de E. coli,
obteve-se uma concentração de 725 µg/mL, que representa um rendimento
de 29µg de DNA, ou seja, 290 µg de DNA/g de célula de E. coli.
A
análise para verificar a integridade do DNA utilizou-se a reação de
PCR, com os oligonucleotídeos amplificadores da região do 16S rDNA,
obtendo-se um fragmento de 430 pares de base, esta amplificação mostrou
que o DNA está integro, confiável para estudos utilizando-se de PCR a
partir de DNA extraído por este método.
Para
comprovar a possibilidade da utilização do DNA extraído, por este
método, para técnicas mais refinadas, como clonagem de grandes
fragmentos de DNA em vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosomal),
efetuou-se a análise dos DNAs extraídos em eletroforese de campo
pulsado por 11 horas, que mostrou uma fragmentação do DNA aceitável,
apresentando fragmentos que variaram de 48.500 pares de base a 291.000
pares de base, mostrando assim que é viável a utilização desta técnica
para construção de BACs (Dados não apresentados).
O
método de extração utilizando carbonato de silício como ferramenta
para romper a parede celular de bactérias gram-positivas e
gram-negativas, visando a extração de DNA, mostrou-se eficiente,
apresentando resultados satisfatórios quando comparados com os métodos
descritos na literatura (2) e de baixo custo, quando comparado com os
métodos tradicionais (2).
ROSA, Daniel Dias.
Método rápido de extração de DNA de bactérias. Summa phytopathol.,
Botucatu,
v. 34,
n. 3, set.
2008
.
Disponível em
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-54052008000300011&lng=pt&nrm=iso>.
acessos em
28
nov.
2012.
http://dx.doi.org/10.1590/S0100-54052008000300011.
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