PREPARO DAS AMOSTRAS

O PCR é muito versátil. Muitos tipos de amostras podem ser analisados para ácidos nucleicos. A maioria de PCR utiliza o DNA como alvo, em vez de RNA, por causa da estabilidade da molécula de ADN e a facilidade com a qual o DNA pode ser isolado. Ao seguir algumas regras básicas, os problemas podem ser evitados na preparação de ADN para a PCR. Os critérios essenciais para qualquer amostra de ADN é que ela contém pelo menos um filamento de DNA intacto engloba a região a ser amplificada, e que todas as impurezas sejam suficientemente diluídas de modo a não inibir o passo de polimerização da reação de PCR.

Embora qualquer protocolo é aceitável para efeitos de PCR, é muitas vezes melhor utilizar o menor número de passos possíveis na preparação de ADN, a fim de evitar a contaminação acidental com DNA indesejado. Normalmente, uma diluição de 1:5 da amostra com a água é suficiente para diluir todas as impurezas que podem resultar a partir do protocolo de purificação.

O método mais simples de isolamento de DNA a partir de células é a seguinte:

As células podem ser obtidas por meio de um palito de dentes para raspar sob as unhas, limpando o interior da boca ou das raízes de cabelos arrancados. Independentemente da fonte, as células são suspensas em 20 ul de água. Ir para a etapa quatro.

Se você estiver usando células suspensas na mídia, centrifugar a 1200 - 1500xg por 5 minutos. Suspender o sedimento de células em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) e por centrifugação a repellet 1200 - 1500xg durante 5 minutos. Repetir. Estas lavagens PBS remova o meio, e os seus fatores de inibição, a partir da superfície das células. Após a última lavagem, suspender o sedimento celular em 20 ul de água destilada. Estar cientes de que os detritos celulares em excesso pode inibir a reação de PCR. Se isto acontece, pode ser necessário para aumentar a diluição da amostra de DNA. Vá para a etapa quatro.

Para amostras bacterianas tomar um palito de dente e raspar os dentes, ou limpe a garganta, ouvidos ou entre os dedos. Material de suspender em 500ul de água. Congelar e descongelar por três vezes, com agitação vigorosa ou agitação em vórtice entre as repetições para quebrar a parede celular bacteriana. Embora não seja DNA todos serão libertados das células, haverá uma quantidade suficiente para PCR. Vá para a etapa quatro.

Colocar a amostra no bloco de aquecimento a 95 ° C, ou em água a ferver, durante 5 minutos. Este passo inativa as moléculas de ADNase que são encontrados na preparação da amostra. Se for deixado intacto, ADNase pode cortar a molécula molde de ADN em fragmentos desejado que seria inadequado para a PCR. Se há muito pouco DNA na preparação da amostra, o DNA pode ser concentrado por precipitação com etanol. A amostra está pronta para a PCR.

As amostras de ADN para a PCR - independentemente do método de preparação - são geralmente processadas em duplicado a fim de fornecer um controlo para a qualidade relativa e pureza da amostra original. Adicionando uma pequena quantidade de DNA de controlo só depois da etapa de mistura principal permite a detecção de qualquer coisa na preparação de amostras concluída que iniba a reação de PCR.