SEXAGEM FETAL

Atualmente é raro encontrar casais que preferem esperar o momento do parto para satisfazer a curiosidade quanto ao sexo do bebê. Cada vez mais, eles têm pressa em saber se o filho vai ser um menino ou uma menina, para o quanto antes lhe dar um nome, fazer planos, comprar o enxoval e até preparar e decorar o quarto tão sonhado. Hoje, para a alegria dos pais, não é mais preciso esperar até a 17ª semana para fazer a ultra-sonografia com este objetivo. Com apenas um pouquinho de sangue da mamãe, com oito semanas de gestação, já é possível saber o sexo do bebê, independente da posição do feto para fazer a identificação. Após a grande descoberta do cientista chinês Y. Dennis Lo, de que no plasma materno existe DNA do feto, o biólogo molecular José Eduardo Levi, do Banco de Sangue do Hospital Sírio Libanês, realizou um estudo por seis anos para desenvolver um teste que identifica fragmentos do cromossomo Y no sangue materno. Estamos falando da Sexagem Fetal, um teste que, embora esteja sendo realizado desde 2003 aqui no Brasil, e ficando cada vez mais popular, ainda é desconhecido pela maioria dos casais. O teste é realizado através da análise do DNA fetal presente no sangue da mãe, pela técnica PCR (Reação em Cadeia de Polimerase), isto é, a amplificação do DNA. Durante a gestação existe a passagem de uma pequena quantidade de células fetais para o sangue materno, através da placenta. O exame dessas células revela o sexo fetal por um procedimento não-invasivo e sem riscos, pois requer apenas a coleta de uma amostra de no máximo 20ml de sangue da mãe. A enorme sensibilidade da PCR permite detectar pequenas quantidades de DNA fetal presente no plasma materno. Este teste fundamenta-se na identificação de partes do cromossomo Y - aquele que determina o sexo masculino no ser humano - na circulação materna. Após a coleta, o plasma é separado e o DNA, isolado do mesmo, é submetido à reação de PCR com oligonucleotídeos iniciadores derivados do gene DYS14 específico do cromossomo Y. O método de PCR desenvolvido para a determinação do sexo fetal possui excelente sensibilidade e especificidade, permitindo seu uso rotineiro e com índices de acerto superiores a 99% a partir de 8 (oito) semanas de gestação conforme Figura 1. Trocando em miúdos, a Sexagem Fetal é um teste não invasivo, com excelente grau de acerto, a mulher não precisa de nenhuma preparação especial (não há necessidade de jejum) e todas as grávidas podem se submeter a ele. Com uma pequena amostra do sangue da mãe pode se encontrar poucas quantidades de DNA do feto. A presença do cromossomo “Y” indica que é um menino e a ausência dele, uma menina. No caso de gêmeos, se forem idênticos, univitelinos, o resultado é válido para os dois fetos. Em gêmeos fraternos, bivitelinos, o resultado “Y”, significa que ao menos um dos gêmeos será menino. Se o resultado der ausência de cromossomo “Y” pode-se dizer que ambas são meninas. O teste pode ser feito nos maiores hospitais e laboratórios do Brasil e o resultado sai em aproximadamente 5 (dias) dias úteis. O valor do exame custa em torno de R$300,00 a R$450,00.

LIMITAÇÕES

·         Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primers específicos;

·         Relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho;

·         Limitada extensão da sequência;

·         Incorporação errônea de bases durante a replicação.

VANTAGENS

·         Capacidade de amplificar uma sequencia precisa de DNA;

·         Simplicidade, elevada sensibilidade e especificidade;

·         Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão a especificidade;

·         Técnica rápida, barata e segura.

PREPARO DAS AMOSTRAS

O PCR é muito versátil. Muitos tipos de amostras podem ser analisados para ácidos nucleicos. A maioria de PCR utiliza o DNA como alvo, em vez de RNA, por causa da estabilidade da molécula de ADN e a facilidade com a qual o DNA pode ser isolado. Ao seguir algumas regras básicas, os problemas podem ser evitados na preparação de ADN para a PCR. Os critérios essenciais para qualquer amostra de ADN é que ela contém pelo menos um filamento de DNA intacto engloba a região a ser amplificada, e que todas as impurezas sejam suficientemente diluídas de modo a não inibir o passo de polimerização da reação de PCR.

Embora qualquer protocolo é aceitável para efeitos de PCR, é muitas vezes melhor utilizar o menor número de passos possíveis na preparação de ADN, a fim de evitar a contaminação acidental com DNA indesejado. Normalmente, uma diluição de 1:5 da amostra com a água é suficiente para diluir todas as impurezas que podem resultar a partir do protocolo de purificação.

O método mais simples de isolamento de DNA a partir de células é a seguinte:

As células podem ser obtidas por meio de um palito de dentes para raspar sob as unhas, limpando o interior da boca ou das raízes de cabelos arrancados. Independentemente da fonte, as células são suspensas em 20 ul de água. Ir para a etapa quatro.

Se você estiver usando células suspensas na mídia, centrifugar a 1200 - 1500xg por 5 minutos. Suspender o sedimento de células em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) e por centrifugação a repellet 1200 - 1500xg durante 5 minutos. Repetir. Estas lavagens PBS remova o meio, e os seus fatores de inibição, a partir da superfície das células. Após a última lavagem, suspender o sedimento celular em 20 ul de água destilada. Estar cientes de que os detritos celulares em excesso pode inibir a reação de PCR. Se isto acontece, pode ser necessário para aumentar a diluição da amostra de DNA. Vá para a etapa quatro.

Para amostras bacterianas tomar um palito de dente e raspar os dentes, ou limpe a garganta, ouvidos ou entre os dedos. Material de suspender em 500ul de água. Congelar e descongelar por três vezes, com agitação vigorosa ou agitação em vórtice entre as repetições para quebrar a parede celular bacteriana. Embora não seja DNA todos serão libertados das células, haverá uma quantidade suficiente para PCR. Vá para a etapa quatro.

Colocar a amostra no bloco de aquecimento a 95 ° C, ou em água a ferver, durante 5 minutos. Este passo inativa as moléculas de ADNase que são encontrados na preparação da amostra. Se for deixado intacto, ADNase pode cortar a molécula molde de ADN em fragmentos desejado que seria inadequado para a PCR. Se há muito pouco DNA na preparação da amostra, o DNA pode ser concentrado por precipitação com etanol. A amostra está pronta para a PCR.

As amostras de ADN para a PCR - independentemente do método de preparação - são geralmente processadas em duplicado a fim de fornecer um controlo para a qualidade relativa e pureza da amostra original. Adicionando uma pequena quantidade de DNA de controlo só depois da etapa de mistura principal permite a detecção de qualquer coisa na preparação de amostras concluída que iniba a reação de PCR.

VARIAÇÕES DA TÉCNICA BÁSICA DE PCR

Nesterd PCR: para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequencias localizada fora dela, e utilizando-se à amplificação da real sequencia alvo.

Hot Start: variação da PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas.

Atividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a preparação da reação. Evitando a amplificação de produtos inespecíficos, aumentando a especificidade e melhorando o rendimento da reação.

Real time PCR: PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, porém a detecção do resultado é realizada dos ciclos através de marcadores. O risco de contaminação se torna melhor.

RAPD-PCR: consiste na amplificação randômica do DNA, ou seja ao acaso, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos. Essa técnica permite a tipagem do genoma de microrganismo, possibilitando sua comparação entre isolados de amostras clinicas.